miR-200a-3p在胆囊癌中的表达及其作用与机制

孔祥海，胡敏，王笛乐，王李理，何涛

（华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院普通外科，湖北武汉430014）

胆囊癌是一种来源于胆囊上皮的恶性肿瘤，约占全部胆道肿瘤的80%～95%[1-2]。全球肿瘤流行病学调查显示，2018年约有22 万例新发患者和超过15 万例患者死于胆囊癌[3]。与其他消化道肿瘤相比,胆囊癌起病隐匿,早期可通过直接浸润、淋巴结和血液扩散转移[4-5]。由于肿瘤筛查不足和缺乏特异性肿瘤标志物，大多数患者在确诊时已进入中晚期，5年生存率低于5%[6]。深入研究胆囊癌的发病机制对提高诊治水平具有重要的意义。microRNA（miRNA）是一种长度为17～25 nt 的短链高度保守的非编码RNA，其主要通过与靶基因mRNA 的3'-UTR 端互补序列结合以降解或抑制靶基因mRNA 而沉默基因表达[7-8]。文献[9]报道miRNA 可通过调节下游特定靶基因抑制肿瘤细胞侵袭和增殖。miR-200a-3p 是新鉴定的miRNA 分子，基因位于22 号染色体上，在非小细胞肺癌[10]、胃癌[11]、视网膜母细胞瘤[12]、肾细胞癌[13]中发挥抑癌基因的作用，但是在卵巢癌[14]中却扮演癌基因的角色。尽管如此，miR-200a-3p 在胆囊癌中的表达情况，及对增殖和侵袭的影响及机制鲜见报道。本研究旨在探讨胆囊癌患者癌组织和细胞系中miR-200a-3p 表达情况及对细胞增殖和侵袭的影响，并探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1 临床组织标本采集

本研究纳入我院普外科于2016年1月—2020年12月收治并接受胆囊癌切除术的32 例患者，其中男18 例，女14 例；平均年龄（58.9±5.0）岁。采集胆囊癌患者术后癌及癌旁组织并保存于-80 ℃冰箱待测。纳入标准：⑴通过病理和影像学诊断为胆囊癌的患者；⑵均接受胆囊癌切除术。排除标准：⑴存在其他部位的肿瘤患者；⑵临床检验资料不全者。本研究经我院伦理委员会批准并符合赫尔辛基宣言。

1.2 主要仪器和试剂

胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996、NOZ，及正常人胆囊上皮细胞系HGBEC 由华中科技大学同济医学院附属协和医院肝胆胰外科实验室赠予。Notch2、上皮间质转化（EMT）相关分子（E-cadherin、vimentin）、GAPDH 一抗和HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 二抗购自美国Abcam 公司。RIPA 试剂盒、BCA蛋白试剂盒、ECL 试剂盒、胰蛋白酶和Lipofectamine ™ 3000 转染试剂购自美国Thermo Scientific 公司。TransScript II Green 两步法qRT-PCR SuperMix（AQ301-01）和TransScript Green miRNA 两步法qRT-PCR SuperMix（AQ202-01）试剂盒购自广州锐博生物公司。MTT 细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。Transwell 试剂盒购自美国Gibco 公司。RT-PCR 仪购自美国BD 公司。上海吉玛公司负责miR-200a-3p 模拟物序列、miR-200a-3p抑制物序列及阴性对照序列的设计和合成。

1.3 细胞培养及分组

胆囊癌细胞系（GBC-SD、SGC-996、NOZ）及正常人胆囊上皮系HGBEC 在含有10%FBS、青霉素-链霉素DMEM 培养基中培养，在37 ℃和5%CO2的加湿培养箱中培养。细胞转染采用Lipofectamine™3000 试剂盒，对GBC-SD 及NOZ 细胞系按试剂盒说明书转染miR-200a-3p 模拟物（miR-200a-3p 过表达组）、miR-200a-3p 抑制物（miR-200a-3p 沉默组）、阴性对照序列（阴性对照组），转染成功后行后续实验。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验

使用TRIzol 试剂盒提取细胞系、癌和癌旁组织中的总RNA，通过紫外分光光度计测定其浓度和纯度，然后按照试剂盒指导进行逆转录。反应条件：95 °C 15 min；95 °C 15 s；58 °C 30 s；72 °C 15 min，共35 个循环。每个标本设3 个复孔，每个标本测定3 次，以U6 作为miR-200a-3p 内参。使用2-ΔΔct法计算miR-200a-3p 的相对表达量。miR-200a-3p引物序列正向引物：5'-TAA CAC TGT CTG GTA ACG ATGT-3'，逆向引物：5'-CAT CTT ACC GGA CAG TGC TGG A-3'。U6 引物序列正向引物：5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，逆向引物：5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'。

1.5 细胞增殖测定

采用MTT 实验测定细胞增殖能力，将转染24 h的3 组细胞以4×106个细胞/孔置于96 孔板中，置入后0、24、48、72 h 每孔加入10 μL MTT 溶液和90 μL DMEM 培养液，然后37 ℃下培养2 h 后，通过酶标仪测量每孔在490 nm 处的光密度值A490nm。

1.6 细胞侵袭测定

将转染24 h 的3 组细胞以5×104个细胞/孔置于6 孔板上。将细胞和DMEM 培养液（200 μL）置于上隔室，将500 μL 含20% FBS 的DMEM 培养液置于下隔室。37 ℃培养48 h 后，擦去未能穿膜的基质和细胞。漂洗3 次，多聚甲醛固定10 min。穿膜的侵袭细胞用0.5%结晶紫染色，并在200×视野下用显微镜进行计数分析。

1.7 Western blot检测

收集各组培养细胞，RIPA 裂解提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。总蛋白通过12%SDS-PAGE分离，转膜至PVDF 膜上。加入Notch2（1∶300）、E-cadherin（1∶200）、vimentin（1∶300）及GAPDH（1∶500）一抗并在4 ℃下孵育过夜，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶500）在室温下孵育1 h。ECL 化学发光试剂盒用于检测目标蛋白条带，扫描条带灰度，通过Quantity One 计算其灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.8 miR-200a-3p靶基因预测和验证

MiRBD/Targetscan7.2/starBase2.0/miRtarbase 网站用于预测miR-200a-3p 的下游靶基因。采用荧光素酶实验验证 miR-200a-3p 的靶基因，使用Lipofectamine™3000 试剂盒将miR-200a-3p 模拟物分别与PmirGLO-Notch2-3'UTR 野生型质粒（WT）、pmirGLO-Notch2-3'UTR 突变型质粒（MUT）共转移到HEK293T 细胞中。荧光素酶活性用萤火虫荧光素酶活性检测试剂盒进行检测。

1.9 统计学处理

本研究采用SPSS 20.0 进行数据分析，GraphPad 7 进行绘图。多组比较通过方差分析进行，在方差分析有意义的基础上采用LSD-t检验行两组间比较，多个时间点的数据通过重复测量方差比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-200a-3p在胆囊癌组织及细胞系中的表达

胆囊癌组织中miR-200a-3p 表达量低于癌旁组织[（1.63±0.65）vs.（4.38±1.13），P＜0.05]（图1A）；胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996、NOZ中miR-200a-3p表达量分别为1.18±0.06、1.06±0.05、0.87±0.04，正常人胆囊上皮系HGBEC 中miR-200a-3p 表达量为3.54±0.12，胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996、NOZ中miR-200a-3p 表达量低于正常人胆囊上皮系HGBEC（均P＜0.05）（图1B）。

图1 qRT-PCR检测miR-200a-3p的表达A：miR-200a-3p在胆囊癌组织与癌旁组织中的表达；B：miR-200a-3p在胆囊癌细胞系与胆囊上皮细胞系中的表达Figure 1 Expression of miR-200a-3p determined by qRT-PCRA:Expressions of miR-200a-3p in gallbladder cancer and adja-cent tissues; B:Expressions of miR-200a-3p in gallbladder cancer cell lines and normal human gallbladder epithelial cell line

2.2 转染效率检测

GBC-SD 及NOZ 细胞系经转染miR-200a-3p 模拟物及抑制物序列后，行qRT-PCR 检测，结果显示，两种细胞的miR-200a-3p 过表达组miR-200a-3p 表达量均高于各自的阴性对照组（均P＜0.05），两种细胞的miR-200a-3p 沉默组miR-200a-3p 表达量均低于各自的阴性对照组（均P＜0.05），提示转染成功，可行下步实验（图2）。

图2 qRT-PCR检测转染效率Figure 2 Determination of transfection efficiency by qRT-PCR

2.3 miR-200a-3p对胆囊癌细胞增殖的影响

MTT 实验显示，转染24 h 后，两种细胞各组的A490nm值差异无统计学意义（均P＞0.05），转染48、72 及96 h 后，两种细胞的miR-200a-3p 过表达组A490nm值均明显低于各自的阴性对照组（均P＜0.05），两种细胞的miR-200a-3p 沉默组A490nm值均明显高于各自的阴性对照组（均P＜0.05）（图3）。

图3 miR-200a-3p对胆囊癌细胞增殖的影响Figure 3 Influence of miR-200a-3p on proliferation of gallbladder cancer cells

2.4 miR-200a-3p对胆囊癌细胞侵袭能力的影响

GBC-SD 及NOZ 细胞系经转染miR-200a-3p 模拟物及抑制物序列后，Transwell 实验显示，两种细胞的miR-200a-3p 过表达组侵袭细胞数均少于各自的阴性对照组（均P＜0.05），两种细胞的miR-200a-3p沉默组侵袭细胞数均多于各自的阴性对照组（均P＜0.05）（图4）。

图4 miR-200a-3p对胆囊癌细胞侵袭能力的影响Figure 4 Influence of miR-200a-3p on invasion abilities of gallbladder cancer cells

2.5 miR-200a-3p靶基因预测

在线预测网站（Targetscan 7.2/starBase 2.0/miRBD/miRtarbase）检索分析显示miR-200a-3p 和Notch2 存在潜在结合位点（图5A）。荧光素酶实验发现，miR-200a-3p 导致Notch2 野生型质粒pmirGLO-Notch2-3'UT WT 荧光素酶活性明显降低，而 miR-200a-3p 对 Notch2 突变型质粒pmirGLO-Notch2-3'UTR MUT 的荧光素酶活性没有影响（图5B）。

图5 miR-200a-3p的靶基因预测A：在线网站预测miR-200a-3p与Notch2存在靶向结合位点；B：荧光素酶实验验证Notch2为miR-200a-3p的靶基因Figure 5 Prediction of target genes of miR-200a-3pA:Binding sites between miR-200a-3p Notch2 predicted by online website analysis;B:Luciferase assay verification showing Notch2 is the target gene of miR-200a-3p

2.6 miR-200a-3p 表达与Notch2 及EMT 相关分子蛋白表达的关系

GBC-SD 及NOZ 细胞系经转染miR-200a-3p 模拟物及miR-200a-3p 抑制物序列后，两种细胞的miR-200a-3p 过表达组E-cadherin 蛋白表达量高于各自的阴性对照组、vimentin 蛋白表达量低于各自的阴性对照组、Notch2 蛋白表达量低各自的于阴性对照组（均P＜0.05）。两种细胞的miR-200a-3p 沉默组E-cadherin 蛋白表达量低于各自的阴性对照组、vimentin 蛋白表达量高于各自的阴性对照组、Notch2 蛋白表达量高于各自的阴性对照组（均P＜0.05）（图6）。

图6 miR-200a-3p的表达对Notch2及EMT相关分子蛋白表达的影响Figure 6 Effects of miR-200a-3p on the expressions of Notch2 protein and EMT-associaed molecules

3 讨论

胆囊癌患者病死率高的原因主要在于其起病隐匿，无明显早期临床特征，易于忽视；已诊断的胆囊癌常处于晚期，不适合手术，放化疗效果差；胆囊癌患者缺乏有效的筛查手段[15-16]。临床上缺乏针对胆囊癌特异性的肿瘤标志物，因此寻找对胆囊癌具有特异性的肿瘤标志物显得尤为重要。

miRNA 是不具有编码蛋白质功能的短链RNA，其主要功能是与靶基因mRNA 的3'-UTR 末端结合而调控下游靶基因的转录，起到抑制或降解靶基因的作用[17]。miR-200 家族共有5 组成员，包括miR-200a家族、miR-200b 家族、miR-200c 家族、miR-429 家族及miR-141 家族[18-19]。miR-200a-3p 属于miR-200 家族，基因定位于染色体22q21.12 上，在炎症反应[20]、心肌缺血再灌注损伤[21]和肿瘤中发挥重要的调控作用。在脑损伤诱导的脓毒症中，miR-200a-3p可通过诱导活性氧促进炎症反应[20]。依据miR-200a-3p 结合的靶标分子功能不同，miR-200a-3p 在不同的肿瘤中发挥抑癌或促癌作用。在非小细胞肺癌[10]中，miR-200a-3p 呈低表达，且miR-200a-3p低表达与预后差相关，上调miR-200a-3p 可抑制胰岛素受体底物2（insulin receptor substrate 2，IRS2）表达，进而抑制细胞增殖、迁移及侵袭过程。在胃癌[11]中，miR-200a-3p 起抑癌基因的作用，miR-200a-3p 可靶向调节Krüppel 样因子12（KLF12）表达，且上调miR-200a-3p 可抑制胃癌细胞增殖和侵袭，并诱导细胞周期停滞。视网膜母细胞瘤[12]中，miR-200a-3p 可通过介导PI3K-Akt/MAPK-ERK 信号通路抑制细胞增殖、侵袭及EMT 过程。在肾细胞癌[13]中，miR-200a-3p 在癌组织中呈低表达，过表达miR-200a-3p 通过靶向结合E3 泛素蛋白连接酶，抑制肾细胞癌细胞增殖及迁移过程，并诱导细胞凋亡。然而，miR-200a-3p 在卵巢癌[14]却是促癌基因，miR-200a-3p 高表达与肿瘤大小、转移及TNM分期相关，并可促进细胞增殖、克隆形成及侵袭过程。本研究发现miR-200a-3p 在胆囊癌组织中表达水平较正常癌旁组织显著降低，提示miR-200a-3p 可能发挥抑癌基因功能。为探究miR-200a-3p 参与胆囊癌发病的分子机制，在体外细胞实验中过表达及沉默胆囊癌细胞系（GBC-SD、NOZ）中miR-200a-3p 表达水平，进行细胞增殖及侵袭实验，发现上调miR-200a-3p 表达后，GBC-SD 及NOZ 细胞系细胞增殖能力受抑制，侵袭细胞数减少；反之，下调miR-200a-3p 表达后，可促进GBC-SD 细胞系细胞增殖能力，侵袭细胞数增加。表明miR-200a-3p在胆囊癌中可能扮演抑癌基因的角色。这与非小细胞肺癌[10]、胃癌[11]、视网膜母细胞瘤[12]、肾细胞癌[13]中的结果一致，但与卵巢癌[14]中的结果相反。可能与肿瘤的异质性及与miR-200a-3p 结合的靶基因所扮演的不同功能有关。

EMT 是指上皮细胞失去原有极性，从而获得抗凋亡和较强的迁移及侵袭能力，进而转化为间质细胞的过程，在上皮源性肿瘤中发挥重要作用[22-23]。本研究发现上调miR-200a-3p 后，代表上皮的标志物E-cadherin 蛋白表达水平上调，而代表间质的标志物vimentin 却下调表达，抑制miR-200a-3p表达后，E-cadherin 蛋白下调表达，而vimentin 上调表达，提示miR-200a-3p 过表达可抑制EMT 过程，这可能是miR-200a-3p 发挥抑癌作用的机制之一。

Notch2 是一种编码跨膜蛋白的基因，作为膜结合配体的受体并与相邻细胞发生相互作用[24]。Notch2 的改变通常与癌症特别是膀胱尿路上皮癌密切相关[25]。Notch 信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，可调节细胞增殖、凋亡、分化及组织器官发育过程[26]。Notch 可通过PI3K/Akt 及Wnt/β-catenin 信号通路发挥促进细胞增殖和分化、抗凋亡的作用[27]。Notch 通路在EMT 中起关键作用，Notch2 是Notch 信号通路中的重要因子之一，在卵巢上皮癌中，Notch2 分子被外泌体miR-34b 分子调控，并参与卵巢癌的EMT 过程[28]。研究发现miR-146a-5p 通过靶向Notch2 介导食管鳞状细胞癌的EMT 过程[29]。本研究通过在线网站预测和荧光素酶实验发现miR-200a-3p 靶基因是Notch2。对胆囊癌细胞系GBC-SD 及NOZ 转染miR-200a-3p 模拟物序列上调miR-200a-3p 表达后，Notch2 蛋白表达受抑制。反之，转染miR-200a-3p 抑制物序列下调miR-200a-3p 表达后，Notch2 蛋白表达量上调，这进一步验证了Notch2 为miR-200a-3p 的靶标分子。在本研究发现上调miR-200a-3p 表达后，Western blot 结果显示EMT 相关蛋白表达量发生变化，且Notch2 为miR-200a-3p 作用的靶基因，提示上调miR-200a-3p表达可能通过下调Notch2 分子抑制EMT 过程，进而发挥抑癌功能。

由于本研究是在体外细胞系中的初步研究，尚存在一定不足之处，比如：上调miR-200a-3p 同时上调Notch2 对癌细胞表型及下游分子改变的影响，miR-200a-3p 表达与胆囊癌患者术后预后的关系等，都值得进一步研究。

综上，miR-200a-3p 可抑制胆囊癌细胞增殖和侵袭过程，发挥抑癌基因功能，机制可能与下调Notch2 及抑制EMT 过程有关。