生物炭对土壤细菌种群多样性的影响

侯宁，宋秋颖，王启全，张楠楠

（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

Cr是一种有毒重金属物质，近年来现代工业高速发展，环境中Cr含量逐渐升高，严重破坏生态环境，危害人体健康。生物炭（Biochar，BC）是在限氧条件下通过生物质热解获得的材料，因其具有良好介孔结构及丰富的表面官能团，已被应用于各类型环境污染物吸附研究[1]。目前，Yang等发现生物炭在降解污染物方面存在潜在应用[2]，被大量用作光催化反应催化剂或催化剂载体应用于污染物降解以及环境修复中[3]。万文亚研究表明，加入生物炭可抑制光生空穴-电子对复合，且拓宽光吸收范围，提高光催化性能，从而提高污染物降解效率[4]。

值得注意的是，Purakayastha等研究表明生物炭在处理重金属方面效果突出[5]，而生物炭在处理重金属过程中对环境尤其是环境微生物造成的影响目前鲜为人知，这一问题影响未来生物炭推广和使用。

本研究在生物炭对重金属处理方面具有突出效果基础上，探究不同来源生物炭施加对环境微生物的影响：①大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭表征分析；②大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭对Cr（Ⅵ）污染土壤中黑麦草生长影响分析；③大豆秸秆生物炭与脱水污泥生物炭对土壤细菌多样性影响。研究旨在为秸秆合理利用策略提供理论依据，为生物炭光催化降解污染物修复环境污染提供科学依据，对生物炭应用推广具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭材料制备

大豆秸秆取自黑龙江省哈尔滨市东北农业大学农学院实验实习基地。脱水污泥取自哈尔滨市文昌污水处理厂。大豆秸秆及脱水污泥经清洗后烘干，粉碎，在80℃烘箱内烘干过夜。使用管式炉500℃温度下制备大豆秸秆生物炭（D500）及脱水污泥生物炭（S500）。炭化后样品经研磨过筛（100目）后备用。

1.1.2 土壤来源

土壤样品来自于黑龙江省哈尔滨市东北农业大学向阳试验示范基地常年耕作土壤。供试土壤pH、有机质和阳离子交换量（CEC）分别为7.12、10.22和16.14 cmol·kg-1，土壤中总N、总P、总K含量分别为1.1、0.96、20.8 g·kg-1。

1.2 大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭材料表征

使用傅里叶红外变换光谱，可对大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭含有基团定性分析。

利用扫描电镜分析分析大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭表面构型。

本文使用XRD分析大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭，XRD主要参数为：40 kV，40 mA，2θ角扫描范围10°~60°，扫描速度2°·min-1。

1.3 盆栽试验

使用黑麦草作为本试验指示性植物。利用盆栽试验开展大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭对Cr（Ⅵ）污染土壤修复研究。

试验具体方法如下：剔除土壤中植物根茎，粉碎土壤，在通风处风干后过2 mm筛，每盆装入2 kg试验土待用。将0.1 mg·mL-1Cr（Ⅵ）溶液1 000 mL拌入土壤中，分为4个试验组：试验组1（同时加入大豆秸秆生物炭D500 100 g）、试验组2（同时加入脱水污泥生物炭S500 100 g）、试验组3（Cr（Ⅵ）污染土壤），试验组4（空白对照组CK），充分混匀，保证供试土壤完全浸湿。静置24 h稳定土壤环境。

试验期间，土壤含水量始终保持在60%，测定玻璃温室内日间温度为29℃，夜间温度为22℃。每经过2 d相互交换盆栽在温室中位置，保证盆栽培养条件相同。在玻璃温室中开展为期30 d盆栽试验。

1.3.1 植物生长、生理指标测定

使用直接收获法，盆栽试验第30天时，取出植物用水清理后去除表面水分，使用直尺测量黑麦草株高和根长，将植物放入烘箱烘干后使用电子天平称量确定植物生物量。

1.3.2 土壤中细菌多样性检测

盆栽30 d后收集各试验组土壤，并将试验组1、2、3和4土壤样本送至上海生工生物工程有限公司作高通量16S rRNA测序，检查土壤样本中细菌群落相对丰度和样本多样性。

1.4 统计分析

所有试验重复3次。图片和表格中数值表示平均值。使用Origin 2020分析平均值和标准偏差。

2 结果与分析

2.1 大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭表征

2.1.1 傅里叶红外光谱分析

傅立叶红外光谱结果如图1所示，图1a为500℃温度下制备大豆秸秆生物炭（D500）红外光谱图，分析发现生物炭上具有-OH（3 000 cm-1）、芳香基团（1 400 cm-1）、羧基（-COOH1 600 cm-1）等含氧官能团。其中芳香苯环（C=C）所代表芳香族结构可提高生物炭电子传递能力，使生物炭作为氧化还原介质，促进环境中非定域化氧化还原反应发生[6]。与此同时，大豆秸秆生物炭因羧基基团（-COOH）使大豆秸秆生物炭具备一定光敏性，羧基基团（-COOH）与其他含氧官能团（即-OH，OC-O和C-O）共同在生物炭光催化产生自由基氧化物质（ROS）过程中发挥重要作用[7]。图1c为脱水污泥生物炭（S500）红外光谱图，可发现脱水污泥生物炭官能团与大豆秸秆生物炭官能团十分相似。

将脱水污泥生物炭（S500）主要官能团含量（见图1b）与大豆秸秆生物炭（D500）中主要官能团含量（见图1d）作对比，发现S500中官能团主要为1 400 cm-1处羧基（-COOH）基团以及500 cm-1附近=C-H基团，大豆秸秆生物炭（D500）中-OH基团（3 000 cm-1）与C-H基团（3 500 cm-1）相较于脱水污泥生物炭（S500）有所增加。

图1 生物炭FTIR光谱Fig.1 FTIR spectrum of biochar

2.1.2 大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭扫描电镜分析

图2是大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭扫描电镜表征结果。由图2a可见，脱水污泥生物炭（S500）多级孔隙结构明显，孔形状规则，表面积大，这种特点赋予生物炭良好吸附性能。通过图2b可发现，大豆秸秆生物炭（D500）纵面结构存在孔隙，且孔隙均匀，呈椭圆形，孔径内壁光滑，孔内仍有组织断续连接。综上，生物炭孔隙结构丰富，可作为一种富孔碳材料，为去除污染物提供充足吸附位点。

图2 生物炭扫描电镜结果Fig.2 Scanning electron micrograph of biochar

2.1.2 大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭XRD分析

图3为脱水污泥生物炭（S500）和大豆秸秆生物炭（D500）X衍射光谱图，热解碳化后两种生物炭XRD曲线中均发现两个明显的包峰，为非晶XRD线形。XRD曲线中存在微弱石墨相碳衍射峰，代表生物质原料在热解过程中发生石墨化，且生物炭中还存在大量非石墨化杂碳所致。石墨烯以及氮化碳（C3N4）共轭聚合物等石墨碳化物均具有优良光催化性能，说明石墨化结构有利于增强生物炭光催化活性。生物炭中形成的石墨相碳结构，通过建立π共轭能带的sp2杂化碳结构，降低带隙能量，提高导电性，促进光催化过程中载流子扩散与转移，提高光催化活性。

图3 生物炭XRD光谱Fig.3 XRD spectrum of biochar

2.2 大豆秸秆生物炭和脱水污泥生物炭对Cr（Ⅵ）污染土壤黑麦草生长的影响

经30 d盆栽试验，结果如图4所示。黑麦草在CK、Cr（Ⅵ）污染以及脱水污泥生物炭（S500）和大豆秸秆生物炭（D500）修正后，30 d不同组黑麦草生长趋势大体相似，但不同组间株高、根长和生物量却差异显著（P<0.05），其中，大豆秸秆生物炭（D500）修复效果最佳，经两种生物炭修复过土壤中生长的黑麦草长势均优于受Cr（Ⅵ）污染土壤中生长的黑麦草。值得注意的是，经大豆秸秆生物炭（D500）修复过土壤中生长黑麦草长势较未污染土壤中生长黑麦草旺盛。综上，生物炭具有良好Cr（Ⅵ）修复效果和土壤改良效果，在污染修复同时促进植物生长。

图4 Cr(Ⅵ)胁迫对黑麦草生长指标的影响Fig.4 Effect of Cr(Ⅵ)stress on growth index of ryegrass

2.3 土壤的细菌群落结构及种群多样性分析

从丰度稀释曲线（图5a）中可看出，当序列数量大于10 000时OTU种数量进入一个增长缓慢趋于平缓阶段。从Shannon指数稀释曲线（图5b）中可看出，当序列数量到达2 000时，Shannon指数曲线已达到平台期，即表明曲线趋近于平缓，说明随测序深度增加，出现的细菌新属开始减少，同时新检测到细菌属己不再是该生境中优势细菌。

图5 丰度及Shannon指数稀释曲线Fig.5 Richness and Shannon rarefaction plot

如图6所示，4个样品共产生11 010个OTU，试验组1~4土样所包含OTU数目分别为3 255、2 970、2 324和2 641。仅有950个OTU同时出现在4组土样中，由此可推论脱水污泥生物炭（S500）和大豆秸秆生物炭（D500）投加改变污染土壤细菌种群结构，提高Cr（Ⅵ）污染与空白（CK）细菌种群结构相似性。

图6 不同处理土壤细菌OTU分布Fig.6 Distribution of soil bacteria OTU in different treatments

本研究确定在Cr（Ⅵ）污染条件下，土壤中不同来源生物炭对Cr（Ⅵ）污染修复后引起土壤细菌种群结构组成变化。通过高通量测序技术对土壤样品16S rRNA作基因测序。第30天时采集土壤样品，各样本数据信息统计见表1。共获得178 433个高质量细菌V3~V4 Illumina序列，每个读数范围为58 655至62 117个序列，用于进一步分析。97%序列相似度水平下，可发现在质量控制之后剩余reads数目中试验组1>试验组2>试验组4>试验组3。物种丰度通过Chao1指数与ACE指数高低体现，试验组1物种丰度高于试验组2，且二者均高于试验组3与4。

表1 各样本数据信息统计Table 1 Statistics of each sample data

各样本中土壤细菌多样性由Shannon指数估算，试验组1多样性高于试验组2，且二者均高于试验组3与4。比较4组样本Shannon指数可知，4个土壤样本中细菌群落多样性排序为：试验组1>试验组2>试验组4>试验组3。研究发现生物炭本身含有大量有机物质，具有比表面积大和多孔隙结构等特性，其特性改善土壤结构，调节土壤pH，为微生物提供适宜生存环境，提高细菌种群多样性。

2.4 大豆秸秆生物炭与脱水污泥生物炭对土壤细菌门影响分析

基于OTU物种分类结果，在门分类级别上分析各样本中细菌种类和相对丰度。如图7a所示，添加大豆秸秆生物炭与脱水污泥生物炭后对样品中细菌丰度影响较大。土壤样品中细菌在门水平上分类大致相同，但比例略有不同。4个样品中，变形杆菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroide⁃tes）以及酸杆菌门（Acidobacteria）占比超过土壤门丰度75.01%，与丁自立研究发现重金属污染土壤对不同重金属污染修复的细菌菌落主要分为三大类（变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门）结果一致[8]；其中变形杆菌门（Proteobacteria）在试验组3中占比为62.06%；试验组4中占比为55.19%；在试验组1中占比为47.10%；在试验组2中占比为55.35%，结果表明，铬处理改变土壤细菌种群结构组成，大豆秸秆生物炭与脱水污泥生物炭施加使受污染土壤恢复至无污染土壤水平。施用生物炭处理后拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）群落丰度增加，可能是由于生物炭孔径结构对细菌起“庇护”作用，生物炭孔径结构比土壤更丰富，更好为细菌提供居住场所，使大量细菌附着于生物炭表面。以上结果表明生物炭对土壤细菌种群结构具有一定积极影响。

图7 细菌种群结构和物种丰度Fig.7 Bacterial population structure and species abundance

2.5 大豆秸秆生物炭与脱水污泥生物炭对土壤细菌属影响分析

图7b为每组土壤样品中微生物在属水平分布情况。通过各组土样之间属水平上物种多样性比较可发现，鞘安醇杆菌属（Sphingomonassp.）、芽孢杆菌属（Bacillusssp.）、交替赤杆菌属（Altereryth⁃robactersp.）等生长状况良好，可能是由于生物炭孔径结构比土壤更易为细菌提供居住场所，使大量细菌附着于生物炭表面；红育菌属（Ramlibactersp.）、甘蔗糖菌属（Saccharibacteria-genera-incer⁃tae-sedissp.）物种丰度呈下降趋势，可能是因土壤中存在Cr（Ⅵ）污染，该菌属对Cr（Ⅵ）敏感，导致部分菌属处于被抑制状态。这种现象可能与生物炭吸附选择性有关。

试验组1~4相比鞘安醇杆菌属（Sphingomonassp.）、芽孢杆菌属（Bacillusssp.）、交替赤杆菌属（Altererythrobactersp.）等在Cr（Ⅵ）污染土壤中均可生长，表明其强耐受能力；在本研究中鞘安醇杆菌属、芽孢杆菌属与交替赤杆菌属等是污染土壤中优势菌属，且环境中Cr（Ⅵ）还原菌数量远低于耐受菌，所以Cr（Ⅵ）耐受机制在环境中应用更广泛。

3 讨论与结论

生物炭结构、理化性质与结构功能关系，以及生物炭对土壤性质影响被大量研究[9]。生物炭在实际修复过程中对土壤微生物影响尚不明确。土壤微生物是土壤中生物群落重要组成且在土壤改良方面有重要作用[10]，是土壤健康重要指标[11-12]。本研究证明生物炭施加改变土壤群落丰度及多样性，对细菌群落组成有显著影响，且可恢复污染地区土壤微生物种类和丰度，促进污染地区土壤改良。生物炭因其固有多微孔结构、较大比表面积等特征，施入土壤后为细菌提供栖息场所并保护其生命活动[13]，促进微生物生长。

鞘安醇杆菌属（Sphingomonassp.）、芽孢杆菌属（Bacillusssp.）、交替赤杆菌属（Altererythrobactersp.）等是Cr（Ⅵ）污染土壤中优势菌属，这一结果与姜蒙研究重金属污染土样中筛选耐受细菌结果一致[14]；芽孢杆菌属（Bacillusssp.）具有较强Cr（Ⅵ）还原性，与冯淏得出铬耐受还原菌研究结果一致[15]；环境中Cr（Ⅵ）还原菌数量远低于耐受菌，所以Cr（Ⅵ）耐受机制在环境中应用更广泛，且研究表明，耐受Cr（Ⅵ）细菌往往可耐受多种其他重金属[8]，说明Cr（Ⅵ）耐受菌在应对复合重金属污染方面具有巨大潜能，本研究对重金属耐受菌属分离和筛选具有指导意义。不同来源生物炭处理使Cr（Ⅵ）污染土壤中细菌种群多样性有所恢复，且由于生物炭制备来源不同，土壤中细菌种群多样性恢复情况也不同。经两种脱水污泥生物炭与大豆秸秆生物炭处理后Cr（Ⅵ）污染土壤中细菌种群多样性均与未污染组相似，群落结构恢复至无污染水平，但仍有物种丰度呈下降趋势细菌，可能是由于制备过程粗糙、原料来源不一，表面基团种类和性质有限等缺点造成，因此需通过改性方法赋予生物炭某些特性，提高生物炭对污染物去除效率，提升生物炭实际修复效果。

受污染地区植物生长状况反映受污染地区修复程度及修复后土壤质量[16]，本研究中经两种生物炭修复土壤中生长植物各项指标均显著优于受污染土壤中植物各项指标，且是经D500修复后，植物长势甚至优于未污染土壤中植物长势。这可能与生物炭促进土壤中微生物丰度密切相关，微生物可促进土壤中营养物质积累，改善土壤性质从而促进植物生长。然而在实际修复过程中生物炭对微生物生长促进机制及对植物生长促进机制有待于进一步研究。

综上所述，生物炭施加为微生物创造良好生存环境，提高土壤中微生物丰度，刺激微生物活动和生长，这有利于土壤有机质分解、提高土壤肥力、促进植物生长，对土壤生态环境具有积极意义。