棕榈酸对绵羊单核巨噬细胞炎性因子和氧化应激水平的影响

2021-09-09姚玉昌赵多维肖十雨卢畅亓美玉

东北农业大学学报 2021年7期

姚玉昌，赵多维，肖十雨，卢畅，亓美玉

（1.黑龙江普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室，哈尔滨 150030；2.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；3.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150086）

脂肪酸（Fatty acid，FA）是由偶数个碳原子组成的直链脂肪族羧酸，可调节细胞内信使传递[1]、影响部分关键基因转录[2]，对细胞代谢存在直接调控作用。脂肪酸按其碳链长度可分为短链（2-4 C）、中链（6-10 C）及长链（12-26 C）脂肪酸，按其饱和度又可分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。研究表明，高浓度长链饱和脂肪酸具有一定细胞毒性，可诱导炎性因子过量表达[3]、ROS产生、细胞自噬和凋亡通路的激活[4]；而长链n-3多不饱和脂肪酸则具有一定程度缓解作用[5]。棕榈酸（Palmitic acid，PA）作为一种典型长链饱和脂肪酸，具有较强的脂毒性作用，可引起细胞内过度炎症反应[6]和氧化应激[7]。亚麻酸（Linoleic acid,LNA）作为一种n-3类多不饱和脂肪酸，可缓解过度炎症反应[8]，改善细胞氧化应激状态[9]。

Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）作为一种模式识别受体，可特异性识别革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖（LPS）成分，激活MyD88依赖和非依赖信号通路，在多种细胞中诱发炎症、氧化应激、自噬和凋亡等生物学反应[10-12]。TLR4基因除可被LPS激活外，其还可被长链饱和脂肪酸激活，进一步活化其下游信号通路[13]，诱发细胞中过度炎症和氧化应激产生[14]。前期研究结果表明，在活体水平上高浓度PA可诱发绵羊单核巨噬细胞和脂肪组织中炎性因子表达上调，激活TLR4基因下游MyD88依赖信号通路，但TLR4基因确切介导作用仍不明确[15]。

因此，本研究分离培养绵羊单核巨噬细胞，揭示PA处理后细胞中炎性因子表达和氧化应激水平变化趋势，探讨TLR4基因在此过程中介导作用，分析LNA可能存在的缓解效应，为阐明长链饱和脂肪酸调控免疫细胞代谢相关机制提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品收集

选择健康、体况良好18~21月龄德国肉用美利奴公羊6只，饲养于东北农业大学绵羊新品种培育基地，每日提供全价精饲料0.5 kg，自由采食羊草，自由饮水。颈静脉采集全血50 mL，置于含有肝素的抗凝管中，用于单核巨噬细胞分离。

1.2 脂肪酸：BSA络合物制备

将0.2 g PA加入至1 mL无水乙醇中溶解，作为储存液；利用预热枪头取10µL储存液加入至1 mL 10%无脂肪酸的BSA（A6003，Sigma）中，震荡30 min，42℃加热30 min，重复此过程至完全溶解。37℃水浴过夜络合后，0.22µm滤器过滤，-20℃保存待用。

将0.1 g LNA加入至2 mL无水乙醇中溶解，环境中充入氮气排氧，避免LNA被氧化，作为储存液；取40µL储存液加入至1 mL 10%无脂肪酸的BSA（A6003，Sigma）中，震荡30 min，42℃加热30 min，重复此过程至完全溶解。37℃水浴过夜络合后，0.22µm滤器过滤，-20℃保存待用。

1.3 单核巨噬细胞分离及培养

采集的抗凝血用HBSS按1∶1稀释，小心加至等体积淋巴细胞分离液（购自天津灏洋生物制品科技有限公司）液面上，2 500 r·min-1（×500 g）离心20 min，此时离心管中由上至下细胞分4层，收集第2层絮状乳白色淋巴细胞至离心管中，2 300 r·min-1（×500 g）离心7 min，弃上清。将所得沉淀细胞利用PBS吹打重悬2次，再用RPMI-1640培养基重悬后，以每个孔1×105个细胞密度接种于12孔板中，待单核巨噬细胞贴壁生长后，再用含0.2% FBS的低血清RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2恒温培养箱培养。

根据文献报道[16-17]和课题组前期研究，本试验中给予1 mmol·L-1的PA和LNA处理细胞。设置对照组（含有等浓度BSA，相同体积的培养液）、LPS（100 ng·mL-1）处理组（L4391，Sigma）、PA（1 mmol·L-1）处理组（P5585，Sigma）、LNA（1 mmol·L-1）处理组（L1012，Sigma）、PA（1 mmol·L-1）+TAK242（3µmol·L-1）共处理组和PA（1 mmol·L-1）+LNA（1 mmol·L-1）共处理组。其中TAK-242提前预处理6 h，LNA预处理1 h。每组设置3个重复孔，于处理后4 h收集样品用于后续分析。

1.4 实时荧光定量PCR

收取单核巨噬细胞，按照RNA提取试剂盒（RE-03113，FORE GENE）说明书提取总RNA。取1µL RNA样品在1.5%琼脂糖凝胶上120 V电压电泳10 min，检测RNA完整度。利用超微量分光光度计（61010-1，DeNovix）检测RNA样品纯度和浓度，调整RNA浓度至同一水平。按照反转录试剂盒（RR037Q，TaKaRa）说明书，反转录后得到cDNA。利用ABI7300实时荧光定量PCR检测系统和FastStart Universal SYBR Green Master（S2024，Roche）试剂盒，检测TLR4、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、SOD、iNOS、CAT等基因表达水平，以β-actin为内参基因，采用相对定量法测定基因表达水平。所用的引物信息见表1，由南京金唯智生物技术公司合成。扩增体系为10µL反应混合体系，含有5µL SYBR Green Master，上、下游引物各0.4µL，3.2µL ddH2O和1µL cDNA模板；反应条件为：50℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，退火1 min，40个循环；每孔设置3个重复。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.5 Western blot

收集PA和LNA处理4 h后单核巨噬细胞，利用含有蛋白酶抑制剂（SCP0110，Roche）和PMSF（329-98-6，Roche）的RIPA缓冲液（P0013B，Bey⁃otime）裂解。随后，使用BCA蛋白质检测试剂盒（P0012S，Beyotime）对蛋白质进行定量。将等量蛋白质在12%SDS-PAGE上分离，并转移到PVDF膜（DVPP00010，Millipore）上，与抗TLR4（1∶1 000；AF7017，Affinity）的一抗孵育后，和辣根过氧化物酶偶联的二抗（1∶1 000；A0208，Beyotime）孵育，通过化学发光使膜可视化（Thermo Fisher Scientific），利用ImageJ软件分析蛋白质条带。

1.6 ROS染色

在各组处理结束前40 min时，于37℃条件下将10µmol·L-1DCFH-DA（E004，南京建成）加入至细胞培养液中，利用荧光显微镜（Olympus，X71）观察细胞内氧化DCF引起的荧光值，绿色荧光信号代表ROS水平。

1.7 氧化和抗氧化指标检测

于PA和LNA处理4 h后，刮取培养皿上单核巨噬细胞并离心收集沉淀，超声波破碎。利用总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒（A015-1，南京建成）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（A001-3，南京建成）、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（A007，南京建成）、一氧化氮合酶（NOS）测定试剂盒（A014-1，南京建成）检测细胞中氧化和抗氧化指标水平，具体操作步骤和判定标准参照说明书执行。

1.8 数据分析

利用SPSS 18.0软件对数据作单因素方差分析（ANOVA）分析和Duncan多重比较。“*”代表P<0.05，表示差异显著；“**”代表P<0.01，表示差异极显著。所有数据均为平均值±标准误（Mean±SEM）。

2 结果与分析

2.1 单核巨噬细胞中TLR4基因表达变化

利用实时荧光定量PCR和Western blot检测各处理组中TLR4基因表达水平，结果见图1。在1 mmol·L-1PA处理4 h后，TLR4基因表达水平上调，与LPS刺激后趋势相似，均显著高于对照组（P<0.05）；利用TAK242抑制TLR4基因后，其表达水平显著下调（P<0.05），与对照组间差异不显著（P>0.05）；PA与LNA共处理后，TLR4基因的表达水平也显著下调（P<0.05），与对照组间差异不显著（P>0.05）；而LNA单独处理对TLR4基因表达水平无显著影响（P>0.05）。

图1 不同处理条件下绵羊单核巨噬细胞中TLR4基因表达水平Fig.1 Expression of TLR4 gene in sheep mononuclear macrophages under different treatment

2.2 单核巨噬细胞中炎性因子表达变化

利用实时荧光定量PCR检测各处理组中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子表达水平，结果见图2。在1 mmol·L-1PA处理4 h后，IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6基因表达上调，其中IFN-γ和IL-1β基因表达水平显著高于对照组（P<0.05），TNF-α和IL-6基因表达水平极显著高于对照组（P<0.01），整体上各炎性因子表达变化与LPS刺激后趋势相似；利用TAK242抑制TLR4基因后，TNF-α和IL-6基因表达水平极显著下调（P<0.01），4种炎性因子表达水平与对照组间均差异不显著（P>0.05）；PA与LNA共处理后，TNF-α和IL-6基因表达水平也极显著下调（P<0.01），4种炎性因子表达水平与对照组间均差异不显著（P>0.05）；而LNA单独处理对以上4种炎性因子表达无显著影响（P>0.05）。

图2 不同处理条件下绵羊单核巨噬细胞中各炎性因子表达水平Fig.2 Expression levels of inflammatory factors in sheep mononuclear macrophages under different treatment

2.3 单核巨噬细胞中氧化应激相关指标的变化

利用实时荧光定量PCR检测各处理组中iNOS、SOD、CAT等氧化应激相关基因表达水平，结果见图3。在1 mmol·L-1PA处理4 h后，iNOS基因表达水平显著高于对照组（P<0.05），SOD和CAT基因表达水平显著低于对照组（P<0.05），整体上与LPS刺激后趋势相似；利用TAK242抑制TLR4基因后，iNOS基因表达水平显著下调（P<0.05），3个氧化应激相关基因表达水平与对照组间均差异不显著（P>0.05）；PA与LNA共处理后，对3个氧化应激相关基因表达无显著影响（P>0.05）；而LNA单独处理对以上3种氧化应激相关基因表达也无显著影响（P>0.05）。

图3 不同处理条件下绵羊单核巨噬细胞中氧化应激相关基因表达水平Fig.3 Expression levels of oxidative stress related genes in sheep mononuclear macrophages under different treatment

利用氧化应激试剂盒检测各处理组中iNOS、CAT、SOD、T-AOC等氧化和抗氧化指标变化结果见图4。在1 mmol·L-1PA处理4 h后，iNOS水平显著升高（P<0.05），SOD、CAT、T-AOC水平显著降低（P<0.05），整体上与LPS刺激后趋势相似；利用TAK242抑制TLR4基因后，iNOS水平显著下降（P<0.05），T-AOC水平显著升高（P<0.05），4个氧化应激相关指标水平与对照组间均差异不显著（P>0.05）；PA与LNA共处理后，iNOS水平也显著下降（P<0.05），T-AOC水平显著升高（P<0.05），4种氧化和抗氧化指标水平与对照组间均差异不显著（P>0.05）；而LNA单独处理对以上4种氧化和抗氧化指标水平无显著影响（P>0.05）。

图4 不同处理条件下绵羊单核巨噬细胞中氧化和抗氧化指标水平Fig.4 Expression levels of oxidation and antioxidant indices in sheep mononuclear macrophages under different treatments

2.4 单核巨噬细胞中ROS水平变化

DCFH-DA染色结果表明见图5。在1 mmol·L-1PA处理4 h后，ROS的水平显著升高（P<0.05），与LPS刺激后趋势相似；利用TAK242抑制TLR4基因后，ROS水平显著下降（P<0.05），与对照组间差异不显著（P>0.05）；PA与LNA共处理后，ROS水平也显著下降（P<0.05），与对照组间差异不显著（P>0.05）；而LNA单独处理对ROS水平无显著影响（P>0.05）。

图5 不同处理条件下绵羊单核巨噬细胞中ROS水平Fig.5 ROS levels in sheep mononuclear macrophages under different treatments

3 讨论

脂肪酸对细胞代谢调控作用与其碳链长度、双键数量及位置密切相关。目前，研究表明长链饱和脂肪酸具有明显脂毒性，过量累积导致免疫细胞中炎症激活，促炎因子分泌增加[3]。饱和脂肪酸脂毒性与碳链长度呈正比，PA作为含有16个碳的长链饱和脂肪酸，可增加巨噬细胞中IL-1β和TNF-α分泌[18]。本研究结果表明，PA处理绵羊单核巨噬细胞后，IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子表达水平显著上调，与阳性对照LPS处理组表现相近趋势。除LPS以外，脂肪酸也可作为配体激活TLR4基因[13]，其中，PA可被TLR4胞膜外区结构识别，并活化其下游信号通路[19]。Suganami等发现饱和脂肪酸处理TLR4基因突变的小鼠巨噬细胞后，TNF-α合成量显著减少[20]。Sunita等在神经细胞中研究结果也显示，PA可能通过TLR4引起TNF-α和IL-6释放，诱发炎症产生[21]。本研究结果表明，PA处理绵羊单核巨噬细胞后，导致TLR4基因表达上调，炎性因子表达水平升高，而抑制TLR4基因后炎性因子的表达水平显著下降，进一步证明TLR4基因在介导PA诱发的炎性反应过程中扮演重要角色。部分不饱和脂肪酸可起到一定抗炎作用，亚油酸可以在肝癌细胞系中逆转PA诱导的炎症反应，显著抑制IL-8产生[22]；鼠单核细胞研究也表明，n-3类二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸可降低IL-1、IL-2、TNF-α等炎性因子表达水平[23]。本研究表明，LNA作为一种n-3类多不饱和脂肪酸，对绵羊单核巨噬细胞中TLR4基因和炎性因子表达无显著影响，但可在一定程度上缓解PA促炎作用。

一般认为过度氧化应激状态导致免疫细胞中蛋白质翻译异常，影响细胞正常代谢过程。PA可通过损伤线粒体氧化呼吸链正常功能，诱导细胞发生氧化应激反应[24]。PA可在牛输卵管上皮细胞中诱导ROS水平升高[18]。Liu等在大鼠心脏细胞研究中发现PA可通过TLR4下游MAPK通路增强ROS产生，进一步说明ROS产生可能与TLR4激活有关[25]。本研究结果表明，PA处理绵羊单核巨噬细胞后，ROS水平显著升高，而抑制TLR4基因后ROS水平显著下降。PA刺激炎症并分泌产生ROS[26]，ROS可通过TLR4信号通路激活iNOS，导致NO释放，NO通过产生过氧化物酶和超氧化物帮助消灭氧化应激源头[27]。Juntian等发现，PA可以显著提高iNOS表达，导致细胞氧化应激水平提高[28]。

本研究结果表明，PA处理绵羊单核巨噬细胞后，氧化指标水平提高、抗氧化指标水平降低，导致细胞中整体氧化应激水平提高。而抑制TLR4基因后，iNOS等细胞氧化指标显著下降，降低氧化应激水平。多不饱和脂肪酸可抑制饱和脂肪酸诱导的TLR4基因表达[29]，缓解细胞内氧化应激水平。n-3类多不饱和脂肪酸可以抑制巨噬细胞中iNOS表达[30]；摄入n-3类多不饱和脂肪酸后，血液中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量增加，诱发抗氧化指标SOD水平升高，缓解氧化应激状态[31]。本研究表明，LNA对绵羊单核巨噬细胞中TLR4基因表达和抗氧化指标无显著影响，但可在一定程度上通过降低氧化水平缓解PA诱发的氧化应激反应。