解磷菌在复垦土壤中的定殖及促生效果研究

2021-09-09王向英武欣张杰孟会生洪坚平

东北农业大学学报 2021年7期

王向英，武欣，张杰，孟会生，洪坚平*

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学资源环境学院，山西太谷 030801）

采煤引起地表沉陷给矿区生态环境造成重大影响[1]，土地复垦是改善矿区生态环境、保护耕地面积、缓解人地矛盾的重要措施[2]。但工程复垦后的重构土壤，压实严重、结构不良、土壤养分和酶活性低、微生物种类少，严重制约矿区植被生长和生态恢复[3-4]。相比传统复垦方式投资大、周期长、生态效果不稳定等缺点，微生物复垦中许多微生物具有解磷、解钾、固氮等功能，可改善植物营养环境，促进复垦土壤微生物体系恢复，加快复垦土壤向农业土壤转变，缩短复垦周期[5-6]，是目前矿区土地复垦新热点。

山西是煤炭大省，大量采煤沉陷地亟待复垦。同时，由于山西石灰性土质，磷在土壤中固定能力强，生物有效性低[7-8]，矿区土壤常因缺磷导致低固氮率，磷素养分成为提升复垦土壤质量的限制因素。解磷微生物可参与土壤中难溶磷的释放与利用[9]，提高土壤有效磷含量，促进植物生长发育，是维持农业可持续发展重要手段[10]。目前，关于解磷微生物研究主要集中在解磷菌分离、筛选、解磷能力和解磷机理方面[11-12]，以及解磷菌剂施用后对土壤磷素活化和促生作用的评价[13-14]，对解磷菌在土壤中生存和定殖状况不够了解，有关解磷菌在复垦土壤中定殖情况鲜有报道。因此，有必要对解磷菌在复垦土壤中生态学特征深入研究，掌握定殖状况，为充分发挥解磷作用，提升复垦土壤肥力提供理论依据。

荧光假单胞菌是一种重要根际促生菌[15]，具有抑制病原菌、解磷、固氮能力，可产生吲哚乙酸（IAA）、铁载体等促进植物生长[16-17]，在农业生产多有应用，但其在复垦土壤中定殖能力和促生作用尚不清楚。本文以绿色荧光蛋白（GFP）标记解磷假单胞菌w134和w137，通过盆栽试验，研究w134GFP和w137GFP在玉米根际和非根际土壤中定殖以及对复垦土壤磷素活化和玉米生长的影响，以期为山西采煤塌陷区复垦土壤生物修复提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤为石灰性褐土，取自山西省襄垣县采煤塌陷区的复垦土壤，pH 8.18，有机质8.4 g·kg-1，全氮0.32 g·kg-1，全磷0.35 g·kg-1，全钾15.6 g·kg-1，碱解氮12.5 mg·kg-1，有效磷3.28 mg·kg-1，速效钾84.7 mg·kg-1，取回土壤风干后过2 mm筛，混匀备用。

供试肥料：无机肥为尿素（N，46.6%），过磷酸钙（P2O5，16%），硫酸钾（K2O，45%）；有机肥为腐熟鸡粪，其中含有机质27.8%，N 1.68%，P2O51.54%，K2O 0.82%。

供试作物为玉米，品种为大丰。

供试菌株为课题组从山西石灰性土壤中筛选的两株解磷菌w134和w137，经16S鉴定，两株菌均为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。质粒pRTGFP由南京农业大学（南农）钟增涛教授惠赠，具有氨苄青霉素（Amp）和四环素（Tet）抗性[18]。采用电击转化法将pRTGFP质粒转入w134和w137中，记作w134GFP和w137GFP。

标记菌定殖检测：LB固体培养基灭菌后加入抗生素，制成50µg·mL-1氨苄青霉素和50µg·mL-1四环素的双抗平板，平板计数法检测标记菌在复垦土壤中定殖能力。

解磷细菌选择性固体培养基（PVK培养基）[18]，用于计数复垦土壤中解磷菌群数量。

1.2 试验设计

采用电击转化法进行w134和w137的GFP标记，随后利用玉米盆栽试验作定殖能力检测。试验在山西农业大学资源环境学院实验站大棚中完成，将取回的复垦土壤风干过筛后装盆，每盆10 kg。试验为双因素设计，4个施肥处理：不施肥、化肥（CF）、有机肥（M）、化肥+有机肥（CFM）；3个接菌处理：不接菌、w134GFP、w137GFP，共12个处理，每处理3个重复。按等量氮磷钾原则施肥，化肥组：每盆施加尿素6.52 g，过磷酸钙12.5 g，硫酸钾6.66 g。有机肥组：每盆施加鸡粪148 g。化肥+有机肥组：每盆施加肥料为化肥和有机肥各半。种植前将肥料作为底肥一次性施入。每盆接菌液50 mL，菌体浓度109cfu·mL-1，接菌后土壤中初始菌量0.5×107cfu·g-1土。浇水至土壤最大持水量，待水分平衡1 d后播种。玉米出苗7 d间苗，每盆留长势一致的3株。出苗35d采集土样和玉米植株测定各项指标。

1.3 测定项目与方法

复垦土壤中标记菌和解磷菌数量检测：①根际土：采用抖根法收集根际土，取1 g根际土与9 mL无菌水混匀，逐级稀释，取10-5、10-6、10-7稀释度土壤悬浊液100µL涂LB双抗平板；另取100µL涂PVK平板。30℃培养48 h，观察根际土壤中标记菌和解磷菌群数量。②非根际土壤：取10 g非根际土与90 mL无菌水混匀，逐级稀释，涂布方法同根际土，观察非根际土壤中标记菌和解磷菌数量。

土壤速效磷采用NaHCO3浸提—钼锑抗比色法[19]，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法[20]。

玉米植株一次性采集，测定玉米株高、株粗和干鲜重。植株全氮采用硫酸—过氧化氢消煮，凯氏定氮法测定；植株全磷采用硫酸—过氧化氢消煮，钒钼黄比色法测定[19]。

1.4 数据处理

试验数据Excel 2016整理；利用SAS 9.4软件作双因素方差分析；并在双因素方差分析基础上采用Duncan多重比较法比较所有试验处理间差异[21]，P<0.05。

2 结果与分析

2.1 复垦土壤中标记菌定殖能力和解磷菌群数量

试验采用电击转化法将GFP质粒分别转入w134和w137中，荧光显微镜可观察到转化菌体带有强烈绿色荧光（见图1），说明GFP质粒转入w134和w137菌株中且GFP基因成功表达。w134GFP和w137GFP提质粒酶切后电泳见图2，与南农惠赠GFP质粒酶切后条带相同。再次证明GFP质粒已成功转入w134和w137中，可作定殖能力相关研究。

图1 w134GFP和w137GFP荧光照片（40×）Fig.1 Fluorescent photos of w134GFP and w137GFP(40×)

图2 w134GFP和w137GFP质粒酶切电泳Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis of plasmids w134GFP and w137 GFP

标记菌在玉米根际土壤中定殖数量在104cfu·g-1（见表1）。3个施肥组中标记菌定殖数量均大于不施肥组，定殖数量依次为：有机肥组>化肥组≈有机+化肥组>不施肥组。其中有机肥组中标记菌定殖数量最多，M+w137GFP定殖数量最高，约5.97×104cfu·g-1；M+w134GFP定殖数量次之，约3.94×104cfu·g-1，分别是单施w137GFP和w134GFP时定殖数量5.28倍和3.28倍。在非根际土壤中，除有机肥组标记菌定殖数量在104cfu·g-1外，其他处理中标记菌数量均在103cfu·g-1左右，比根际土中低一个数量级。

表1 玉米根际和非根际土壤中标记菌和解磷菌数量Table 1 Populations of w134GFP,w137GFP and phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere and non-rhizosphere soil of maize

解磷菌群数量在根际土中约107cfu·g-1，非根际土中约106cfu·g-1，根际土数量高于非根际土。与标记菌分布状态一致，可见根际是微生物活动主要场所。不论施肥与否，有无标记菌接入，各处理间解磷菌群数量无数量级差异。

2.2 接种解磷菌对复垦土壤中有效磷含量、磷酸酶活性的影响

不同处理对土壤有效磷含量影响见图3。接种解磷菌对复垦土壤有效磷含量影响显著（P=0.02）。相同施肥条件下，接菌土壤比单施肥土壤有效磷含量高：CF+w134GFP比CF有效磷含量提高11.65%；M+w137GFP比M提高8.89%；CFM+w137GFP比CFM提高10.22%。12个处理中，土壤有效磷增幅最大是w134GFP和w137GFP，分别比CK中有效磷含量提高32.89%和16.44%。可见，解磷菌在4种施肥处理中均表现解磷功能，提高土壤有效磷含量。

图3 不同处理条件下复垦土壤中有效磷含量Fig.3 Content of available phosphorus in reclaimed soil under different treatments

图4为不同处理对土壤磷酸酶活性影响。尽管接种解磷菌对土壤磷酸酶影响不显著（P=0.22），但接菌和施肥两者交互作用对土壤磷酸酶影响显著（P<0.05）。化肥+解磷菌处理的磷酸酶活性显著低于单施解磷菌，有机肥+解磷菌处理的磷酸酶活性则高于单施解磷菌。所有处理中，CF+w137GFP处理的磷酸酶活性最低，而M+w134GFP处理的磷酸酶活性最高。可见，化肥对接种解磷菌分泌磷酸酶有抑制作用，有机肥表现促进作用。

图4 不同处理条件下复垦土壤中磷酸酶活性Fig.4 Phosphatase activity in reclaimed soil under different treatments

2.3 接种解磷菌对苗期玉米生长的影响

从表2可知，接种解磷菌对玉米株高影响显著（P<0.01），在相同施肥处理条件下，接种解磷菌处理比对应单施肥处理效果更佳：w134GFP和w137GFP处理的玉米株高比CK高5.5%~6.7%；CF+w134GFP和CF+w137GFP处理的玉米株高比CF高12.7%~15.8%；CFM+w134GFP和CFM+w137GFP处理的玉米株高比CFM高11.6%~18.4%。类似结果在玉米株粗、干鲜重上也有体现，表明四种施肥条件下，接种解磷菌均促进复垦土壤中玉米植株生长。

表2 不同处理条件下苗期玉米株高、株粗、干鲜重Table 2 Plant height,plant diameter,dry and fresh weight of maize under different treatments

2.4 接种解磷菌对玉米植株氮、磷含量的影响

玉米植株含氮量见图5。接种解磷菌对玉米含氮量影响显著（P=0.038），相同施肥条件下，w134GFP和w137GFP处理分别比CK含氮量提高32.05%和37.18%，差异显著（P<0.05）。3个施肥组中，解磷菌+施肥处理比对应施肥处理玉米含氮高，其中M+w134GFP处理玉米含氮量最高，为3.07%，比M处理高18.1%。

图5 不同处理条件下苗期玉米植株含氮量Fig.5 Nitrogen content of maize plant at seedling stage under different treatments

续表

不同处理条件下玉米植株含磷量见图6。尽管接种解磷菌对玉米含磷量影响不显著（P=0.08），但相同施肥条件下，接菌+施肥处理比对应单施肥处理的玉米含磷含量高。

图6 不同处理条件下苗期玉米植株含磷量Fig.6 Phosphorus content of maize plant at seedling stage under different treatments

W134GFP和w137GFP处理分别比CK玉米含磷量提高27.96%和12.83%；CF+w134GFP和CF+w137GFP处理分别比CF提高14.28%和16.76%；M+w134GFP和M+w137GFP处理分别比M提高54.9%和27.1%；CFM+w137GFP处理比CFM提高4.32%。

3 讨论

3.1 标记菌在复垦土壤中的定殖

微生物定殖是指在有土著微生物参与竞争情况下，外来菌株在植物根表或土壤中生长并维持其种群数量的能力[22]。试验借助GFP标记研究解磷假单胞菌w134和w137在复垦土壤中定殖能力。结果发现，接种35 d，w134GFP和w137GFP在玉米根际和非根际土壤中定殖数量基本在约103~104cfu·g-1（见表1），这与课题组前期仅在复垦土壤中35 d定殖数量一致，再次印证标记菌在复垦土壤中定殖能力。

本文所用解磷菌为荧光假单胞菌，作为一种重要根际促生菌[15]，其主要定殖在根际土壤中。夏枫耿等用luxAB发光酶基因标记荧光假单胞菌PF20001，发现其主要定殖在以菜心主根为中心，半径3~4 cm土壤中[23]。张亮等研究发现荧光假单胞菌PEF-5#18可定殖于番茄根际，其定殖数量为根际土壤>根>茎[24]。刘方春等对假单胞菌YT3作绿色荧光蛋白标记发现，YT3-gfp主要定殖于樱桃根际土壤中，根际土壤定殖数量是非根际土壤8.75~28.77倍[25]。本试验得到相近结果，w134GFP和w137GFP在根际土壤中定殖数量高于非根际土。可见，复垦土壤的根际环境更利于菌株定殖，是荧光假单胞菌发挥其解磷、促生等功能主要场所。

外来微生物引入导致土壤原有微生物群落结构和功能发生变化，对生态系统产生正向或负向影响[26]，因此，功能菌株安全性备受关注。Glandorf等将基因修饰和未经修饰的假单胞菌引入田间栽培的小麦根部，发现接种的荧光假单胞菌对土壤微生物种群代谢能力、土壤硝化潜能和纤维素分解能力无影响，说明引入荧光假单胞菌对土壤微生物生态无显著影响[27]。张亮等发现对接种荧光假单胞菌PEF-5#18对番茄根际土壤可培养细菌总数无显著影响[24]。试验证明，接入荧光假单胞菌（w134和w137）对土壤中解磷菌群数量无显著影响（见表1），可见w134和w137是相对安全的功能菌，将在复垦区大田试验中继续探讨未来其对复垦土壤微生物多样性影响。

3.2 解磷菌对复垦土壤磷素活化和对苗期玉米生长的影响

研究报道添加解磷菌提高土壤速效磷含量，增加植株磷素积累量，增加产量或提高果实品质等。孟会生等研究发现解磷菌肥可提高复垦土壤中磷素有效性，提高玉米产量[7]。乔策策等将高效解磷菌NJAU-B8作盆栽和大田试验发现，该菌有效促进苗期玉米生长，增加玉米产量[12]。Chen等从山西复垦土壤中筛选得到解磷菌S32，该菌株对难溶的有机磷和无机磷均表现较高溶解能力，可明显提高复垦土壤中有效磷含量，显著提高水稻植株生长量和吸磷量[13]。栗丽等研究发现，与未接种解磷菌处理相比，解磷菌剂促进磷矿粉和磷酸钙在复垦土壤中磷的生物有效性，提高盆栽油菜磷素吸收[14]。

本试验结果表明，单施解磷菌可促进玉米生长，增加玉米植株氮磷含量和土壤有效磷含量。而解磷菌+肥料大幅度增加标记菌定殖数量、玉米生长量和土壤有效磷含量。说明在复垦土壤中单施解磷菌效果有限，需提供相应营养，助其有效定殖。Ninwe等研究也证实，营养物质是影响荧光假单胞定殖首要因素[28]。复垦土壤养分贫瘠，添加肥料可为解磷菌提供良好载体以及碳、氮等营养物质，这些为解磷菌在土壤中有效定殖提供必要条件。因此，从定殖角度讲，肥料有助于菌株定殖。仅定殖成功解磷菌才可持续发挥解磷作用，促进植物生长，实现复垦土壤向农业土壤转变，缩短复垦周期。