云耳菌株“百云6号”菌丝体对外源硒的耐受性研究*

李发盛，黄雪星**，欧 娜，何达崇，周 兴，曾维铭，罗先群

（1.广西科学院生物研究所，广西 南宁 530003；2.广西科学院，广西 南宁 530003）

硒（Se）是一种非金属元素，是人体不可缺少的微量元素之一，在人体各项生理功能的调节中发挥着重要的作用。研究发现，硒具有抗氧化、调节免疫、预防心血管疾病、抗病毒、抗衰老、抗癌等作用，摄入适量的硒对人体健康有着非常积极的作用，而缺硒会对人体重要器官功能产生影响，导致疾病的发生[1-3]。

食（药）用菌是良好的硒生物转化载体，能够将环境中的无机硒转化为安全高效的有机硒[4]，且食用菌含有丰富的蛋白质和多种营养元素，具有很大的应用潜力。不同浓度、不同形态的外源硒对食用菌生长及品质具有一定影响[4，9]。不同食（药） 用菌品种对硒的忍耐性和富集能力均有差别[4-5]。

广西所产黑木耳，俗称云耳（Auricularia auricula-judae），云耳是广西著名特产，因品质好而远销海内外。通过以云耳为试验材料，研究云耳菌丝体对硒的敏感度及耐受能力，为进一步探究其菌丝体和子实体富硒能力提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

经过自然选育获得的广西本土优良云耳菌株百云6号，已通过国家新品种认定，由广西科学院生物研究所保藏。

1.2 供试培养基、主要试剂和仪器

平板培养基（PDA培养基）：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、VB10.01 g、琼脂粉15 g，自来水1 000 mL，pH自然。

固体培养基：桑枝屑50%、杂木屑40%、麸皮8%、石灰粉1%、石膏粉1%，料液比为1∶1.5，灭菌前pH为8.0～8.5，其中桑枝屑和杂木屑需经40目筛粉化处理。

主要试剂：外源硒化学纯（Na2SeO3），国药集团化学试剂有限公司生产。

主要仪器：电子分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司；高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；生化培养箱，广东省医疗器械厂；数显游标卡尺，上海量刃工具有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 平板培养法测定硒对云耳菌株百云6号菌丝生长的影响

准确配制Na2SeO3添加液的浓度分别为0、10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、60 mg·L-1、80 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1、400 mg·L-1、500 mg·L-1、1 000 mg·L-1的平板培养基 （对应硒浓度依次分别为 0、4.43 mg·L-1、8.86 mg·L-1、17.71 mg·L-1、26.58 mg·L-1、35.43 mg·L-1、44.29 mg·L-1、66.44 mg·L-1、88.58 mg·L-1、132.87 mg·L-1、177.16 mg·L-1、221.45 mg·L-1、442.90 mg·L-1）。121℃灭菌20 min后，趁热分别注入经灭菌并烘干的培养皿（直径9 cm）内，每皿约25 mL。冷却凝固后，于超净台内按无菌操作接入经常规活化的、等量的菌株百云6号菌块，每个梯度浓度重复3皿。接好种的平板于25℃倒置避光培养。当所有供试平板中任意一个培养皿内菌丝基本长满时停止培养，取出所有平板，用游标卡尺测量并记录整个菌落的直径，对菌丝的生长势及菌落形态特征进行观察判断。计算菌丝的生长速度和抑制率，采用SPSS 17.0软件对菌丝生长速度进行差异显著性分析。

1.3.2 计算方法

平板法菌丝生长速度（V，mm·d-1）的计算公式为：

式中：R为菌丝长度（mm）；D为菌丝生长天数（d）。

固体栽培法菌丝生长速度（V，mm·d-1）的计算公式为：

式中：S为菌丝长度（mm）；D为菌丝生长天数（d）。

菌丝生长抑制率（A，%）的计算公式[6]为：

式中：V0为CK组菌丝平均生长速度（mm·d-1）；Vt为各浓度菌丝平均生长速度（mm·d-1）。

1.3.3 固体培养法测定硒对云耳菌株百云6号菌丝生长的影响

准确配制 Na2SeO3浓度分别为 0、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1、60 mg·kg-1、80 mg·kg-1、100 mg·kg-1、150 mg·kg-1、200 mg·kg-1、300 mg·kg-1、400 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1的固体培养基（对应的硒浓度分别为0、4.43 mg·kg-1、8.86 mg·kg-1、17.71 mg·kg-1、26.58 mg·kg-1、35.43 mg·kg-1、44.29 mg·kg-1、66.44 mg·kg-1、88.58 mg·kg-1、132.87 mg·kg-1、177.16 mg·kg-1、221.45 mg·kg-1、442.90 mg·kg-1）。每个浓度准备干料1 000 g，当天17:00分别于塑料盆内拌料、建堆，润料过夜。第2天上午8:00充分拌料均匀后，用12 cm×26 cm×0.05 cm菌袋分装，每个浓度等量均分为5袋。料面高度误差不超过0.3 cm，以确保培养料松紧度的一致性。菌包经0.16 MPa灭菌2.5 h。冷却后，于超净台内按常规无菌操作接固体原种在料面上，并于25℃恒温避光培养。当生长最慢的菌包内的菌丝生长长度达0.5 cm时，即同时于所有供试菌包中菌丝生长的前端划线，作为菌丝生长速度的起始点，继续培养。直到生长最快的菌包的菌丝基本长满时（40 d），用游标卡尺测量并记录菌丝生长长度，对菌丝的生长势及生理变化进行观察描述。按1.3.2的公式计算菌丝的生长速度和抑制率，采用SPSS 17.0软件对菌丝生长速度进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 平板培养法测定硒对云耳菌株百云6号菌丝生长的影响结果分析

2.1.1 不同硒浓度对菌株百云6号菌丝菌落形态特征影响

采用平板法研究不同硒浓度对云耳菌株百云6号菌丝体菌落形态特征的影响，试验结果见图1。

图1 不同硒浓度对菌株百云6号菌丝体生长的影响Fig.1 Effect of different selenium concentrations on the mycelia growth of Baiyun No.6

从图1可以看出，外源硒浓度在0～88.58 mg·L-1时，接种菌块的菌丝恢复生长较快，菌丝生长粗壮有力、洁白、整齐、浓密，菌苔厚实，气生菌丝粗、短，菌落边缘完整。外源硒浓度为88.58 mg·L-1～132.87 mg·L-1时，接种菌块的菌丝恢复生长变慢，菌丝体逐渐变得细弱无力，色泽变浅，气生菌丝少而弱，菌落边缘不整齐。外源硒浓度达到442.90 mg·L-1时，云耳菌株百云6号菌丝体虽然还可以生长，但已受到强烈抑制。

2.1.2 硒对菌株百云6号菌丝生长速度影响

采用平板法研究不同硒浓度对云耳菌株百云6号菌丝体生长速度的影响，试验结果见表1。

表1 不同硒浓度对菌株百云6号菌丝体生长的影响Tab.1 Effect of different selenium concentrations on the mycelia growth of Baiyun No.6

从表1可以看出，菌丝体生长速度受外源硒影响较大。随着硒浓度的升高，菌丝平均生长速度先加快，后减慢。当外源硒浓度≤35.43 mg·L-1时，对菌株百云6号菌丝生长速度有促进作用。与对照（CK）相比，外源硒浓度为8.86 mg·L-1时，菌丝平均生长速度的增加率（抑制率为负数的表示增加率）达到最大，为2.02%，但没有显著性差异；当外源硒浓度≥44.29 mg·L-1时，菌株百云6号菌丝生长开始受到抑制。相对对照（CK） 而言，外源硒的浓度在44.29 mg·L-1～88.58 mg·L-1时菌丝平均生长速度虽然受到抑制，但菌丝长势却没有明显差别；外源硒浓度达132.87 mg·L-1时，菌丝平均生长速度明显受到抑制，抑制率达33.16%，同时菌丝长势也明显变弱；外源硒浓度达到442.90 mg·L-1时，菌株百云6号菌丝生长受到强烈抑制，抑制率达69.06%，菌丝长势更弱。

2.2 固体培养法测定硒对菌株百云6号菌丝生长的影响结果分析

2.2.1 不同硒浓度对菌株百云6号菌丝生理变化影响

采用固体培养法，不同硒浓度对菌株百云6号菌丝生理变化影响试验结果见图2。

图2 不同硒浓度对菌株百云6号菌丝体生长的影响Fig.2 Effect of different selenium concentrations on the mycelia growth of Baiyun No.6

由图2可看出，外源硒浓度在0～442.90 mg·kg-1时菌丝均能正常生长，但随外源硒浓度由低到高，菌丝体在生理方面产生明显变化，主要表现在：当外源硒浓度达到88.58 mg·kg-1时出现条状（索状）菌丝，随着外源硒浓度进一步增加，条状（索状）菌丝越来越明显，其数量也越来越多；产生的黄水越来越多；外源硒浓度在0～66.44 mg·kg-1时菌丝扭结形成的耳芽数量较多，没有显著差异，外源硒浓度≥88.58 mg·kg-1时，菌丝扭结形成的耳芽数量明显减少，当外源硒浓度达到442.90 mg·kg-1时，菌丝已不能扭结形成耳芽。由此说明，这些生理变化与外源硒的胁迫作用有直接关系。

2.2.2 不同硒浓度对菌株百云6号菌丝生长速度影响

采用固体培养法研究不同硒浓度对菌株百云6号菌丝生长速度的影响，试验结果见表2。

表2 不同硒浓度对菌株百云6号菌丝体生长的影响Tab.2 Effect of different selenium concentrations on the mycelia growth of Baiyun No.6 strain

从表2可以看出，随外源硒浓度的升高，菌丝平均生长速度呈现逐步加快至最高，之后逐步减慢的过程。当外源硒浓度≤66.44 mg·kg-1时，其对菌株百云6号菌丝生长速度有促进作用，菌丝体更为粗壮有力。与对照（CK） 相比，外源硒浓度为35.43 mg·kg-1时，菌株百云6号菌丝平均生长速度的增加率达到最大，为6.51%，且具有极显著差异性。当外源硒浓度≥88.58 mg·kg-1时，菌株百云6号菌丝生长速度开始受到抑制，但不明显，不过菌丝体的生理变化却非常明显，如黄水增多、条状菌丝明显、耳芽减少等，直至外源硒浓度达到442.90 mg·kg-1时，菌丝生长速度受抑制率却只有9.25%，但菌丝已不能扭结形成耳芽。

2.3 平板法和固体法外源硒对菌株百云6号菌丝生长影响对比分析

2种培养方法的外源硒对菌株百云6号菌丝生长影响的主要节点相关数据见表3。

表3 外源硒对菌株百云6号菌丝生长影响节点数据Tab.3 Nodal data on the effect of exogenous selenium on mycelia growth of Baiyun No.6

从表3数据可以看出，2种培养方法的外源硒对菌株百云6号菌丝生长影响浓度有较大区别，其中固体培养法外源硒对菌丝生长最大促进的硒浓度、最大生长速度增加率的硒浓度、最大生长速度增加率、最小抑制率的硒浓度、最大抑制率分别是平板培养法的1.88倍、4.00倍、2.61倍、2.00倍、0.13倍，充分说明固体培养法外源硒对菌丝生长的影响度比平板培养法要小很多，与吉清妹等[7]的研究亚硒酸钠对灵芝生长及富硒效应的影响，说明亚硒酸钠对灵芝的抑制作用在木屑培养基中明显比在PDA固体平板培养基上小的结论一致。究其原因，应与培养基质的不同有直接关系。

3 结论与讨论

通过在平板培养法和固体培养法的2种培养基质中添加外源硒对菌株百云6号菌丝生长影响试验结果说明，其菌丝体具有很强的耐硒能力，且于2种培养基质中表现出来的抑制率差别较大。当外源硒浓度≤35.43 mg·L-1（平板法） 和 66.44 mg·kg-1（固体法）对菌丝生长均有促进作用，菌丝体相对对照（CK） 更加粗壮有力；当外源硒的浓度≥44.29 mg·L-1（平板法） 和 88.58 mg·kg-1（固体法） 时，对菌丝生长有抑制作用，抑制率为8.70%（平板法）和0.68%（固体法），之后随硒浓度升高，抑制程度和抑制率随之提高，当外源硒的浓度达到442.90 mg·kg-1时，平板培养法的菌丝生长已受到严重抑制，抑制率达到69.06%，而固体培养法的菌丝生长受到的抑制程度不大，抑制率只有9.52%，但是，菌丝体的生理变化却非常明显，主要是形成的条状（索状）菌丝十分明显且数量多，更为重要的是菌丝体不能扭结形成耳芽，说明菌丝已经不能由营养生长转化为生殖生长。试验结果对菌株百云6号的菌丝体和子实体富硒的进一步研究提供十分有价值的科学依据。

食（药）用菌品种不同，其菌丝体对外源硒的敏感度和忍耐力都会有所不同，甚至差异较大。吴周斌等[6]关于真姬菇菌丝体对硒耐受性的研究发现，硒浓度≤50 mg·L-1时对真姬菇菌丝生长有促进作用，硒浓度≥75 mg·L-1时有抑制作用，真姬菇菌丝对硒最大耐受浓度为 150 mg·L-1～200 mg·L-1。吉清妹等[7]研究亚硒酸钠对灵芝生长及富硒效应的影响表明，浓度为 0.1 g·kg-1～0.8 g·kg-1的亚硒酸钠对4种灵芝的生长速度、子实体的生物量均有抑制作用，且随着浓度的增大而有所加强。宋飞飞等[8]关于无机硒对桑黄（SH623）菌株菌丝生长影响的研究结果表明，外源硒浓度≤18.63 mg·L-1时，其对桑黄菌株菌丝的生长速度影响不显著，当外源硒浓度≥37.25 mg·L-1时，桑黄菌株菌丝生长速度受到显著的抑制，抑制率达到45.86%，SH623菌株对硒的最大耐受浓度约为298.00 mg·L-1。裴冰倩等[9]关于有机硒与无机硒对榆黄蘑菌丝生长的影响研究，结果表明硒浓度为0.05 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、5.00 mg·L-1时均对榆黄蘑菌丝生长有不同程度的抑制。梁英等[10]对黑木耳富硒栽培研究的结果表明，当硒浓度≤80 mg·kg-1时，促进黑木耳菌丝的生长，硒浓度≥80 mg·kg-1时会抑制黑木耳菌丝的生长。因此，对不同食（药）用菌品种进行耐硒研究均有意义。

同一食用菌品种，在不同培养基质中添加外源硒，其菌丝体对硒的敏感度和忍耐力也是不同的。本试验结果和吉清妹等[7]的研究已经证明，这与培养基质所含成分及基质的物理性状等有直接关系，至于其机理究竟如何，尚待进一步探讨。