山东省野生蛹虫草的驯化及杂交育种*

邱文旭，杨芳芳，贾玉萍，封金华，李健平，李维焕，盖宇鹏，程显好**

[1.金孢（山东）食品有限公司，山东 东营 257300；2.山东美奥生物工程有限公司，山东 东营 257300；3.鲁东大学农学院，山东 烟台 264025]

蛹虫草（Cordyceps militaris Link.）又名北冬虫夏草、北虫草，属真菌界（Fungi）双核菌亚界（Bikarya） 子囊菌门 （Ascomycota） 子囊菌纲（Ascomycetes） 粪壳菌亚纲（Sordariomycetidae） 肉座菌目 （Hypocreales） 麦角菌科 （Clavicipitaceae） 虫草属（Cordyceps），是我国重要的虫草资源[1]。主要分布于我国山西、陕西、吉林、河北等省区，是极具开发价值的食药兼用滋补真菌[2]。蛹虫草的有效成分及药理作用与冬虫夏草相似，甚至高于冬虫夏草，其被认为是冬虫夏草理想的替代品[3-5]。研究证实，蛹虫草含有丰富的虫草类主要活性物质，如虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷等，具有滋补营养、增强免疫及抗肿瘤、抑制病毒、抵抗辐射、抗菌消炎等多种营养、保健及药用功效[6-7]，东亚地区将其广泛作为食用及药用保健佳品，我国也于2009年批准其为新资源食品[8]。

目前我国蛹虫草栽培技术已经非常成熟，可以在人工合成培养基上栽培获得蛹虫草子实体[9]，但蛹虫草菌株退化现象严重是产业发展中遇到的普遍性难题，主要表现为优良菌种短期内会出现不长子实体、子实体产量或有效成分含量严重下降等不良状况[10]，此现象将给蛹虫草产业带来无法估计的损失[11]。

野生食用菌的驯化及单孢杂交育种是其生产有效的育种手段。通过采集山东省的野生蛹虫草资源，选育性能优良的菌株，在此基础上通过单孢杂交育种进一步提高其生产性能，以获得蛹虫草新品种，满足企业生产需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要试剂

葡萄糖，天津市大茂化学试剂厂；蛋白胨，北京双旋微生物培养基制品厂；磷酸二氢钾，天津市北联精细化学品开发有限公司；硫酸镁，天津市北联精细化学品开发有限公司；酵母浸出粉，成都市科隆化学品有限公司；琼脂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；乙腈，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；虫草素标准品，中国食品药品检定研究院；腺苷标准品，中国食品药品检定研究院；均为分析纯试剂。马铃薯、燕麦为市购。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

液体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾2 g、硫酸镁1 g，水1 000 mL，pH自然。

栽培培养基：燕麦35 g、蒸馏水55 mL。

1.2 仪器与设备

PR224ZH/E电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；YXQ-50SII立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BSDWX2200卧式智能精密摇床，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2D型（实用垂直新颖）双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；WND-500A型高速中药粉碎机，浙江省兰溪市伟能达电器有限公司；H1705医用离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；KQ-100TDB高频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LC1000高效液相色谱分析仪，北京澳诺科技有限公司；DGX-9243 B-1鼓风干燥箱，上海福玛实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 野生蛹虫草的采集、菌种分离及栽培性能测试

在每年秋季到山东省蒙山、昆嵛山等地采集野生蛹虫草标本。标本带土采集后置于标本采集盒中，当天或次日带回实验室进行菌种分离。菌种的分离按照常规食用菌组织分离法进行[12]。分离菌丝于PDA培养基25℃左右恒温箱培养约20 d。后将蛹虫草菌丝转接至液体培养基中培养，于24℃～25℃、130 r·min-1摇床中培养9 d～10 d，获得液体菌种。每瓶燕麦培养基中接入5 mL液体菌种，25℃避光培养10 d后，搔菌去除培养基表面老菌丝，移入光照培养室20℃培养，直至采收。

1.3.2 子囊孢子收集与分离

采用钩悬法收集蛹虫草子囊孢子。在超净工作台取3根～4根成熟、生长健壮蛹虫草子实体，用无菌棉线将其悬挂于三角瓶内，勿使其接触三角瓶底部、四周瓶壁及瓶口，用封口膜将三角瓶瓶口密封。放入约25℃的恒温箱中，静置24 h后将子实体取出。向三角瓶中加入50 mL无菌水后获得孢子液，加水稀释1 000倍～10 000倍。取0.1 mL涂布于PDA平板上，25℃培养至肉眼可见菌落后，挑取单个菌落至PDA培养基中保存备用。

1.3.3 单孢杂交

采取两点法进行单孢杂交[13]。在超净工作台挑取长势良好的蛹虫草单孢菌丝，两两配对接种于9 cm平板中，2个接种点间相距1.0 cm～1.5 cm，共接种80个杂交平板，并进行编号，将其放入25℃恒温箱中培养7 d～9 d。培养后挑取2个亲本结合处的菌丝，接入PDA平板中。放入25℃恒温培养箱中培养约20 d，观察菌丝生长状态，淘汰菌丝长势差、不转色的杂交菌株。

1.3.4 杂交菌株出菇试验

杂交菌株转接至液体培养基中培养，于24℃～25℃、130 r·min-1摇床中培养9 d～10 d，获得液体菌种。子实体燕麦培养基培养方法参考1.3.1。并测定蛹虫草生物转化率，成熟后，将其子实体全部摘下，称重记为鲜重。生物转化率（V，%）的计算公式为：

V=（G1/G2）×100%

式中：G1为蛹虫草子实体鲜重（g）；G2为培养料干重 （g）。

1.4 虫草素和腺苷的测定

蛹虫草供试菌株与其杂交菌株的子实体和燕麦培养基中虫草素与腺苷的测定参考标准NY/T 2116-2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法[14]。待燕麦培养基中蛹虫草子实体成熟后，摘下全部子实体，将子实体和燕麦培养基分别放入烘干箱中，烘干后研磨备用。测定时，先将研磨样品过80目筛，准确称取0.5 g样品于100 mL容量瓶中，加水约80 mL，置于超声波仪器中超声提取3 h，取出后加水定容。取1 mL样液8 000 r·min-1离心5 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜于试管中，用LC1000型高效液相色谱分析仪测定样品的虫草素和腺苷。

2 结果与分析

2.1 野生蛹虫草的菌种分离及栽培性能测试

2018年～2019年，从山东的蒙山、昆嵛山等地共采集到野生蛹虫草标本36个，并成功分离纯化出菌株32株。

对32个菌株采用燕麦培养基进行了栽培性能测试，其中出草菌株23个，其生物转化率和虫草素、腺苷含量见表1。

表1 野生蛹虫草菌株的栽培性状统计表Tab.1 Statistical table of cultivation characters of wild Cordyceps militaris strains

由表1所示，YC05菌株表现出高产性状，生物转化率到了120%以上，YC03、YC04菌株则表现出高虫草素产量性状，其子实体中虫草素含量分别达到了 359.18 mg·100-1g-1和 502.38 mg·100-1g-1，远高于其他菌株。野外采集蛹虫草标本分离菌株在栽培性能方面表现出很大的差异性，符合蛹虫草易变异的生物学特性[15]，也为育种工作提供了丰富多样的亲本材料。

2.2 子囊孢子收集

性状最优菌株YC03、YC04、YC05子囊孢子收集情况见图1。

图1 菌株子囊孢子生长情况Fig.1 Ascospores growth of strain

由图1所示，收集菌株YC03、YC04、YC05的子囊孢子各20个，淘汰菌丝长势差、不转色的子囊孢子，获得菌丝长势较快、较浓密、转色较为明显的子囊孢子，菌株YC03子囊孢子8个，菌株YC04子囊孢子10个，菌株YC05子囊孢子12个。

2.3 蛹虫草单孢杂交结果

选取菌株YC04性状优良的单孢分别与菌株YC03和菌株YC05单孢进行杂交，其长势情况见图2。

图2 杂交菌株生长情况Fig.2 Growth of hybrid strains

由图2所示，挑选菌丝长势较快、较浓密、转色较为明显的杂交菌株，共获得40株性状优良的杂交菌株。淘汰菌丝长势差、不转色的杂交菌株，将优良杂交菌株进行编号，YC04×YC03的杂交菌株编号为YC4301～YC4316、YC04×YC05的杂交菌株编号为YC4501～YC4524。

2.4 蛹虫草杂交菌株出菇试验结果

对40株性状优良的杂交菌株进行出菇试验，其试验结果见图3、图4。

图3 蛹虫草杂交菌株未出菇的培养基Fig.3 Medium of Cordyceps militaris hybrid strain without fruiting

图4 杂交菌株出菇情况Fig.4 Fruiting situation of hybrid strains

由图3、图4可知，40株优良性状杂交菌株中25株杂交菌株未出菇，其余15株均出菇。其中，菌株 YC4310、YC4311、YC4315、YC4518微弱出菇，生物转化率低于20%，子实体稀疏且矮小；菌株YC4514、YC4520为畸形菇，子实体性状参差不齐、差异较大；菌株YC4307、YC4506、YC4511、YC4523、YC4524长势较好，生物转化率在20%～100%，子实体较为紧密、粗壮；菌株YC4308、YC4313、YC4314、YC4521出菇旺盛，生物转化率高于100%，子实体紧密且细长。

2.5 蛹虫草杂交菌株农艺性状分析

15个出菇杂交菌株的生物转化率、虫草素、腺苷等参数统计结果见表2。

表2 蛹虫草杂交菌株的栽培性状统计表Tab.2 Statistical table of cultivation characters of hybrid strains of Cordyceps militaris

由表2可知，部分杂交菌株在某些性状上出现超亲遗传，菌株YC4308、YC4313、YC4521的生物转化率均高于菌株YC05的生物转化率（120.80%），菌株YC4311、YC4315的子实体虫草素含量高于菌株YC04的子实体虫草素含量（502.38 mg·100-1g-1）。

蛹虫草的生物转化率是决定产量重要因素之一，结果不同的杂交菌株之间生物转化率差异较大，生物转化率最高为141.10%（菌株YC4308），生物转化率最低为15.40%（菌株YC4315）。其中有3株杂交菌株的生物转化率分别为141.10%（菌株YC4308）、132.20% （菌株 YC4313）、122.40% （菌株YC4521），均高于亲本菌株的生物转化率120.80% （菌株YC05）。

虫草素是蛹虫草生长过程中产生的次生代谢产物，是蛹虫草的重要活性成分之一，其含量高低是衡量蛹虫草品质的重要指标。菌株YC4311、YC4315的子实体虫草素的含量高于供试菌株，其中菌株YC4315的虫草素最高为790.96 mg·100-1g-1，但该杂交菌株的生物转化率最低。

腺苷是蛹虫草中除虫草素以外的主要核苷类物质之一，具有广泛的药理活性作用[10]。子实体中腺苷的含量远远高于培养基中的腺苷含量，有13个杂交菌株的子实体腺苷的含量高于菌株YC03（198.36 mg·100-1g-1），其中菌株YC4514子实体中腺苷含最高为 461.14 mg·100-1g-1。

3 结论与讨论

蛹虫草具有多种药用功效，在医疗保健领域具有广阔前景[16]，现在已经有多款产品面市，如蛹虫草酒、蛹虫草复合饮品、蛹虫草压片糖果等[17-18]。如何选育优良的蛹虫草菌株仍是蛹虫草产业的重点。但蛹虫草菌株退化现象严重，而遗传背景和培养条件是造成蛹虫草菌株退化的重要因素[19-20]，其中遗传背景是菌株退化的主要因素[10]。食用菌品种杂交育种是通过亲本遗传物质的交换和重组等产生不同于亲本性状的变异，以获得食用菌品种新菌株[21]。目前该方法是食用菌育种中最常用的方法[22]。

研究采集野生蛹虫草36株，通过子实体组织分离及出菇试验，已成功驯化23株。杂交试验结果表明通过蛹虫草杂交育种可获得性状优于亲本菌株的新菌株。将亲本菌株YC03、YC04、YC05的子实体进行孢子分离并制成孢子悬液，通过涂布培养继而获得单孢子，单孢杂交及出菇试验最终获得15株蛹虫草出菇杂交菌株。其中菌株YC4308、YC4313、YC4521的生物转化率分别为141.10%、132.20%、122.40%，均高于菌株YC05的生物转化率120.80%；菌株YC4311、YC4315的子实体虫草素含量分别为 744.66 mg·100-1g-1、790.96 mg·100-1g-1，高于菌株YC04的子实体虫草素含量502.38 mg·100-1g-1。通过杂交育种的方式，选育出生物转化率和虫草素含量高于亲本的蛹虫草菌株，可促进蛹虫草深加工等行业发展，提高蛹虫草产业的经济效益和社会效益