平菇品种“科大杂优”的母种脱毒技术初探*

张玉萍，王 芳，史兴海

（1.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006；2.山西农业大学农学院，山西 太原 030031）

“科大杂优”是广温型平菇（Pleurotus ostreatus）菌株，是华北地区的主栽品种之一。子实体扇形或半球形，幼时深灰色，栽培菌株原基灰黑色；子实体丛生边缘稍向下卷，后渐灰白色，较平展；菌肉白色，肥厚；菌褶较深且延生，菌柄侧生，污白色[1]。因其较耐高温，广受山西菇农青睐，然而2019年山西柳林、晋中、静乐等地在不同栽培时间段、不同栽培设施内出现了病毒感染，使其品种形成了不同程度的畸形菇。为提高该菌株菇体的产量和质量，将植物的脱毒技术应用于食用菌生产，可有效抑制病害的发生。植物脱毒，是将植物茎尖组织进行分离，将分离组织置于特定培养基中进行培养，从而获得脱离原体病毒、病菌的新生种苗。在脱毒过程中，采取一系列的高温、低温刺激、营养贫乏等技术手段，迫使菌株适应恶劣的条件，能够提高菌株抗性[2]，从而达到提高产量和质量的目的。

王锋尖等[3]采用菌丝尖端脱毒法对白色金针菇（Flammulina velutipes） 菌株脱毒复壮，经3次～5次脱毒复壮后，菌丝体的生长速度、生长量显著高于对照组和1次脱毒；栽培试验表明脱毒菌株与对照菌株相比，发菌期与生产周期均有所缩短，差异不显著，但生物转化率提高了9.92%，差异极显著。陈发川等[4]从秀珍菇（Pleurotus geesteranus） 污染菌包中分离得到的3个秀珍菇菌株为出发菌株，采用挑取尖端菌丝进行菌株复壮，结果表明可以缩短出菇周期并提高出菇产量。吴小平等[5]对香菇（Lentinus edodes）采用菌丝尖端挑取法对3株带毒香菇进行脱毒，获得1株不含ds RNA条带的无毒菌株和一些含1条11 kb的ds RNA条带脱毒不彻底菌株。对脱毒不彻底菌株、无毒菌株以及带毒菌株进行了生物学特性、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶和多酚氧化酶活性的测定，结果显示在pH为8时脱毒菌株的生长速度比带毒菌株快，这三类菌株的子实体产量无显著差异，但脱毒菌株子实体肥厚且抗污染能力强。付月月[6]采用化学药剂进行常温菌丝尖端处理、低温菌丝尖端处理和高温菌丝尖端处理的方式对牛肝菌（Boletus spp.）中的病毒菌株进行了脱毒处理，其中高温菌丝尖端脱除处理可有效脱除牛肝菌中的病毒。

通过采用常温尖端，常温断桥和高温尖端3种方法对该平菇菌株进行脱毒复壮试验，以期对生产实践起到指导作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

采集山西省静乐县丰润镇徐家沟栽培平菇子实体。子实体为深灰色，菌盖花边且呈上卷状，菌褶纹理紊乱，菌柄粗，产量及其商品价值均下降。到目前为止，已发现的平菇病毒主要有3种，即OMSV、OMIVⅠ、OMIVⅡ，病毒颗粒直径分别为27 nm、34 nm、34 nm，OMSV的基因组为单链RNA，OMIVⅠ、OMIVⅡ的基因组为双链RNA，其中OMSV和OMIVⅠ经常共同感染寄主。混有三种病毒或者单个病毒引起的子实体畸形症状较为复杂，并未有明显区别[7]。所采集的供试平菇菌株混有3种病毒或单个病毒。

1.1.2 供试培养基

子实体分离培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g，加水1 000 mL，pH为7。脱毒培养基以及活化母种培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、蛋白胨2 g，加水1 000 mL，pH为7。原种培养料：棉籽皮85.9%、麸皮10%、糖1%、磷肥1%、石膏2%、尿素0.1%。出菇袋配方：玉米芯84%、麸皮10%、石膏1%、石灰3%、磷肥2%。

1.2 试验方法

1.2.1 组织分离母种

按无菌操作技术将平菇子实体撕开，在菌盖与菌柄交界处，用灭菌小镊子取绿豆大菌肉，接入PDA斜面培养基中（18 mm×180 mm），以原始分离菌株为对照组，22℃～25℃恒温培养。

1.2.2 脱毒复壮处理

1） 常温尖端法

挑取组织分离好的母种约2 mm2菌丝块接入18 mm×180 mm试管斜面中，放入恒温培养箱22℃～25℃培养，当菌丝萌发至2 cm时，用接种工具切取菌丝尖端2 mm菌丝转接至试管斜面中，此为1次脱毒。如此循环，经1次～5次连续脱毒所得菌株分别标记为处理C1、处理C2、处理C3、处理C4、处理C5。

2） 常温断桥法

斜面PDA培养基凝固后于无菌条件下，用接种耙将培养基斜面最前端较薄处培养基断开约1 cm，把待接母种转接至试管中间培养基上，22℃～25℃恒温培养，当菌丝长到断开处时，则会继续伸长，穿越断开处，长至前端分离小块培养基上，待菌丝在前端培养基生长1 cm后，用接种工具切取菌丝尖端2 mm菌丝转接至试管斜面后端培养基中，此为1次脱毒，如此循环，经1次～5次连续脱毒所得菌株分别记为处理D1、处理D2、处理D3、处理D4、处理D5。

3） 高温尖端法

挑取组织分离好的母种约2 mm2菌丝块接入18 mm×180 mm试管斜面中，培养箱温度调至32℃～34℃。当菌丝萌发至2 cm时，用接种工具切取菌丝尖端2 mm的菌丝转接至试管斜面中，此为1次脱毒。如此循环，经1次～5次连续脱毒所得到的菌株分别记为处理G1、处理G2、处理G3、处理G4、处理G5。

各菌株母种长好后放入4℃冰箱冷藏，备用。

1.2.3 母种菌丝生长速度测定

活化对照组和各脱毒菌株，挑取活化后各菌株2 mm2组织块置于30 mm×200 mm平底试管斜面底部，22℃～25℃避光培养，待菌丝萌发至试管壁时开始画线，生长5 d后再画线，测量菌丝长度，计算菌丝日平均生长速度（cm·d-1）。每个处理5次重复，每次试验重复3次。

1.2.4 原种菌丝生长速度测定

试验设计既考虑了试验梯度又兼顾工作量，将对照组母种和处理C1、处理C3、处理C5、处理D1、处理D3、处理D5、处理G1、处理G3、处理G5菌株母种制作原种，采用1.1.2原种培养基，常规方法拌料，料水比约为1.0∶1.5，用石灰调节pH为7，拌料均匀后装入500 mL玻璃罐头瓶原种瓶内，要求边装料、边压紧，并把料面整平压实，在中央用锥形木棒扎一洞穴，用清水洗净瓶口，后用一层聚丙烯塑料薄膜包扎。于高压灭菌锅内灭菌后将原种瓶移至接种室内，待温度降至25℃下即可接种，接种后于22℃～25℃培养，待菌丝生长至瓶肩，开始划线，直至瓶底再划线，测量菌丝长度，计算菌丝日平均生长量（cm·d-1）。每组10个重复，每次试验重复3次。

1.2.5 产量测定

将1.2.4原种直接接入22 cm×48 cm聚乙烯栽培袋中，每个处理30个重复，每次试验重复3次。因试验属于同一品种不同菌株，采用以时间段产量为测产依据，开始时间为2020年8月23日，截止时间为2020年10月24日。

1.2.6 数据分析

利用SPSS 21.0，Excel对测定的各菌株相关数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 母种菌丝生长速度比较

2.1.1 各菌株在不同处理方法下母种菌丝生长速度的比较

各不同处理方法的平菇菌株母种菌丝生长速度比较见表1。

表1 各菌株母种菌丝生长速度比较结果Tab.1 Comparison results of growth rate of each strains

由表1可知，常温尖端法中处理C1、处理C3和处理C5的菌丝生长速度均高于CK，但处理C1较CK有显著差异；常温断桥法中处理D1、处理D3和处理D5的菌丝生长速度均高于CK，且处理D5与CK有显著差异；高温尖端法中除了处理G1略高于CK外，处理G3与CK相等，处理G5低于CK，但差异均不明显。

2.1.2 不同处理方法对各菌株母种菌丝生长速度综合比较

不同处理各菌株母种菌丝长速多重比较结果见表2。

表2 各菌株母种菌丝长速多重比较结果Tab.2 The results of multiple comparisons of the growth rate of the female strains of the mycelium

由表2可知，高温尖端脱毒法与对照组之间无明显差异，常温尖端法与常温断桥法母种菌丝生长速度明显快于对照组。

2.2 原种菌丝生长速度比较

2.2.1 各菌株在不同处理方法下原种菌丝生长速度的比较

不同处理各菌株原种菌丝生长速度比较见表3。

表3 各菌株原种菌丝生长速度比较结果Tab.3 Comparison results of primary filament growth rate of various strains

由表3可知，各处理在以棉籽壳为主料的培养基中，除常温尖端法处理C1菌丝生长速度明显低于对照组外；其余各处理原种菌丝生长速度均与CK无明显差异。

2.2.2 不同处理方法对各菌株母种菌丝生长速度综合比较

不同处理各菌株原种菌丝长速多重比较结果见表4。

表4 各菌株原种菌丝长速多重比较Tab.4 The results of multiple comparisons of the mycelium growth rate of the original strains

由表4可知，综合常温尖端、常温断桥和高温尖端3种处理方式，在原种中的菌丝生长速度明显低于对照组。

2.3 产量比较

各处理出菇产量统计见表5，不同处理方法第一潮菇产量比较见图1。

表5 各处理出菇产量Tab.5 Yield of fruiting body rods for each treatment

图1 各菌株第一潮产量比较Fig.1 Comparison of the first-tide yield of various strains

由表4并结合图1可以得出，各处理总产量大小依次为： G1>D1>C1>G3>D5>CK>D3>C3>G5>C5，处理G1总产量最高为15.75 kg，比对照高25%，处理D1次之（14.6 kg），比处理C高15.9%。各处理第一潮菇产量依次为C5>G1>C1>D3>D1=G5>G3>C>C3。由此可知，常温尖端处理方法脱毒一次效果最好，随着脱毒处理次数的增多，产量下降；断桥尖端脱毒1次效果最好，连续处理5次产量无明显变化；高温尖端处理1次最好，随着处理次数的增加，产量下降。

2.4 子实体形状比较

科大杂优原始菌株见图2，常温尖端、常温断桥和高温尖端脱毒菌株分别见图3～图5。

图2 平菇品种“科大杂优”原始菌株Fig.2 Original strain of Pleurotus ostreatus‘Kedazayou’

图3 常温尖端处理后子实体表现Fig.3 Sub-entity after treatment at room temperature

图4 常温断桥处理后子实体表现Fig.4 Sub-entity after normal temperature broken bridge treatment

图5 高温尖端处理后子实体表现Fig.5 Sub-entity after high temperature tip treatment

由图2～图5可知，畸形菇子实体经过组织分离以及常温尖端、常温断桥和高温尖端脱毒后，重新制种进行栽培，子实体外形有所改观，花边，粗柄现象消失，但菌褶紊乱经过3种方法脱毒处理，表现不同。经过常温尖端处理，随着脱毒次数增多，菌褶有所改善；断桥尖端处理5次后，菌褶纹理有序；高温尖端脱毒后，随着脱毒次数增加，菌褶紊乱度下降。

3 讨论

目前，我国己经成为世界上最大的食用菌生产国，人工栽培的食用菌种类最多。菌种在食用菌产业的发展中起着重要且不可替代的作用，菌种的优劣决定栽培的成败[8-10]。因此，分离培育优良菌种对食用菌产业的可持续发展十分重要。在日常生产中，经常会出现菌株退化，菌种老化等现象，而简单、易操作的脱毒、复壮方法，对于菌株的提纯复壮，预防菌种的老化具有非常重要的实践意义[11-12]。

从各菌株母种生长状况看，常温尖端、常温断桥处理对菌丝有很好的复壮、纯化作用，处理C1生长速度最快，随着处理次数的增多，菌丝生长速度下降，对涉及母种转接的生产科研工作具有重要指导意义。常温断桥处理，随着处理次数增多，母种菌丝生长速度增加，处理D5生长速度最快。

从原种菌丝生长速度来看，各处理菌株相较对照而言，均有所下降，并存在显著差异，但随着处理次数的增加，菌丝生长速度有所回升，但处理次数何时可以达到或者超过对照组，有待进一步研究。

试验采用常温尖端法、常温断桥法、高温尖端法对携带病毒（菌） 的平菇畸形菌株脱毒（菌） 处理，从子实体形态看，采用3种脱毒分离方法，子实体外形均有所改观，菌柄粗细适中，菌盖大小匀称，边缘整齐，对菇体的商品价值有所提升。常温尖端，高温尖端法随着处理次数的增多，其子实体菌褶纹理逐渐整齐，常温断桥处理方法对子实体形状起到了很好的修复作用，而且处理D5表现最好，常温断桥处理应不少于5次。

4 结论

衡量一个菌株的优劣，产量是必不可少的重要指标。从各处理菌株总体产量看，高温尖端处理对产量的提高效果最为显著，常温断桥处理次之。平菇品种“科大杂优”作为广温偏高型菌株，能抢季上市非常重要，因此第一潮产量较为关键。从第一潮菇产量，处理C5表现最为突出，第一潮产量达10.70 kg，比对照的第一潮产量提高100%；处理G1第一潮菇产量比对照高出61.7%。这些结果对工厂化栽培，增加单位时间内茬数并获得更高产量，大幅度提高厂房利用率，降低生产成本，增加收益有重要意义[13]。

综合所有因素，对于科大杂优带病毒（菌） 菌株，使用常温断桥方法连续5次处理对菌丝的长速有促进作用，且该方法对菇型的改善和产量的提高均有很大作用，因此常温断桥法是提纯复壮科大杂优带病毒（菌）菌株的最佳方法。