白桦脂酸对异氟醚诱导的发育期大鼠神经细胞损伤的保护作用

王东伟，刘海萍，王庆东，赫 赤，刘思洋，胡玉红，陈 萍，臧荣佳

（佳木斯大学附属第一医院1.麻醉科，2.妇产科，黑龙江 佳木斯 154002）

异氟醚（isoflurane，Iso）是一种临床常用的吸入性全身麻醉药，其可诱导新生动物的大脑神经细胞出现凋亡，严重者可能影响脑功能［1］，且该影响可长期存在，导致神经突触数量减少甚至消失，引起永久脑损伤，可表现为新生大鼠发育成熟后行为功能障碍［2］。白桦脂酸（betulinic acid，BC）是五环羽扇烷型三萜化合物。Ma等［3］研究认为，BC能通过血红素氧合酶1/核因子E2相关因子2/NF-κB信号通路抑制糖尿病模型小鼠的认知障碍。Jiao等［4］研究显示，BC能抑制脑缺血缺氧诱发的小鼠海马神经损伤，具有神经保护作用。本研究以发育期大鼠为研究对象，探讨BC对Iso诱导的发育期神经损伤的保护作用，为临床寻找能够有效减轻或消除Iso导致的发育期神经损伤的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和主要仪器

Iso（江苏恒瑞医药有限公司，批号：20172831）；BC（中国科学院成都生物研究所，批号：18032423）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（上海亨代劳生物科技公司）；线粒体膜电位（mito⁃chondrial membrane potential，MMP）检测试剂盒和Ca2+荧光探针检测试剂盒（BestBios生物科技有限公司）；Annexin Ⅴ-Biotin，Annexin Ⅴ-FITC和Annexin Ⅴ-PE（美国BD公司）。Fabius麻醉机（德国Drager公司）；流式细胞仪（美国Beckman公司）；荧光酶标仪（芬兰Thereto实验仪器公司）；麻醉箱（上海玉研科学仪器公司）；MindrayT8监护仪（深圳迈瑞公司）；Morris水迷宫实验系统（美国National Instruments公司）；血气分析仪（普朗公司）；分光光度计（V-1000，翔艺仪器上海有限公司）。

1.2 实验动物、分组和样本制备

7日龄SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，体重17～20 g，佳木斯大学基础医学院动物中心提供，生产许可证号：SYXK（黑）2016-014。幼鼠在通风良好、室温20～24℃和湿度50%～60%的环境饲养于清洁笼具中，12 h昼夜交替光照。自由进食、进水。

大鼠随机分为4组：正常对照组、Iso组和Iso+BC 100和200 mg·kg-1组，每组20只，雌雄各半。除正常对照组外，其余各组大鼠置恒温水槽上的麻醉箱内吸入1.5% Iso 6 h进行全身麻醉［5］，麻醉箱内温度37～38℃。Iso麻醉前1 h，正常对照组和Iso组ip给予0.9%生理盐水，Iso+BC组分别ip给予BC 100或200 mg·kg-1预处理。处置完毕后对大鼠进行血气分析，然后每组随机取10只大鼠立即处死，每只大鼠取部分海马组织，剪碎后用胰蛋白酶消化，并用200目孔径尼龙网过滤，450×g离心5 min，弃上清，加PBS重悬后反复柔和吹打，制备成1×108L-1的单细胞悬液，用于检测细胞凋亡率、ROS、MMP和神经细胞内游离Ca2+浓度。取部分海马组织剪碎，按质量比1∶9加入预冷的生理盐水，用匀浆器制成匀浆，626×g，4℃离心15 min，取上清，-20℃保存用于检测MDA含量。余下10只返回饲养笼中喂养至6周后进行Morris水迷宫实验。

1.3 流式细胞术检测大鼠海马神经细胞凋亡率

取1.2制备的大鼠海马单细胞悬液，按照试剂盒说明操作，向细胞悬液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC标记抗体，室温避光孵育20 min，再加入5 μL 0.1 g·L-1的PI细胞核染料混匀，室温避光孵育10 min，用流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.4 DCFH-DA探针检测大鼠海马神经细胞ROS水平

按照试剂盒说明书进行操作，取1.2制备的大鼠海马单细胞悬液，加DCFH-DA（终浓度10 μmol·L-1）37℃孵育30 min后，用PBS洗涤2次，用荧光酶标仪（激发波长488 nm，发射波长525 nm）测读，以相对荧光单位（relative fluorescence unit，RFU）反映细胞内ROS水平。

1.5 硫代巴比妥酸缩合法检测大鼠海马组织MDA含量

按照试剂盒说明书进行操作，取1.2制备的海马组织匀浆，加3 mL 20%三氯乙酸，再加入1 mL 0.67%硫代巴比妥酸，用旋涡混合器混匀30 s，95℃水浴40 min，取出后流水冷却，800×g离心10 min，取上清液，用分光光度计在波长532 nm处测定吸光度值，以反映MDA含量。

1.6 Fluo-3/AM探针检测大鼠海马神经细胞内Ca2+浓度

按照试剂盒说明书进行操作，取1.2制备的大鼠海马单细胞悬液，加入Fluo-3/AM探针工作液，在37℃细胞培养箱中避光孵育20 min。加入5倍体积的含有1%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS），继续孵育40 min。用HBSS洗涤细胞2～3次后重悬细胞，37℃细胞培养箱中孵育10 min，用荧光酶标仪（激发波长488 nm，发射波长526 nm）测读，以RFU反映细胞内Ca2+浓度。

1.7 JC-1法检测大鼠海马神经细胞MMP

取1.2制备的大鼠海马单细胞悬液，按照试剂盒操作说明加入 JC-1染色液 10 μmol·L-1，37℃孵育 30 min，626×g，4℃离心 3～4 min，弃上清，用JC-1染色液洗涤2次后重悬细胞，在荧光显微镜下观察JC-1单体（激发波长488 nm，发射波长530 nm，绿色）及JC-1聚合物（激发波长525 nm，发射波长590 nm，红色）的荧光图像。用荧光酶标仪检测荧光强度值（fluorescence intensity，FI），用FI绿/FI红表示MMP水平（△ψm）。

1.8 Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力

经1.2处理的另10只大鼠返回饲养笼中继续饲养至6周后进行Morris水迷宫实验［6］。Morris水迷宫模型由圆柱型水池和可移动位置的平台2部分组成。水池高60 cm，直径120 cm，平台（直径10 cm）淹没固定在水池的4个象限之一。连续4 d，每天4次将大鼠从水池边放入水中进行训练。观察大鼠在水中找到平台并爬上平台的时间，记为逃避潜伏期。如果在120 s内不能找到平台，则人为将其引导到平台，停留10 s，并将逃避潜伏期记为120 s；当大鼠自行到达平台时，可被允许在上面休息30 s。记录第4天4次训练的平均逃避潜伏期。第5天，去除平台后进行空间探索实验，记录120 s内大鼠穿过原平台位置的次数和在原平台象限的探索时间。实验数据由计算机软件自动记录。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 BC对Iso暴露大鼠血气指标的影响

血气分析结果（表1）显示，与正常对照组比较，各组大鼠血液pH值、pO2和pCO2均无统计学差异。

Tab.1 Effect of betulinc acid(BC)on arterial blood gas indexes in isoflurane（Iso）exposure rats

2.2 BC对Iso暴露大鼠海马神经细胞凋亡的影响

Iso组大鼠海马神经细胞凋亡率显著高于正常对照组（P<0.01），Iso+BC 100和200 mg·kg-1组海马神经细胞凋亡率低于Iso组（P<0.05），Iso+BC 200 mg·kg-1组大鼠海马神经细胞凋亡率低于Iso+BC 100 mg·kg-1组（P<0.05）（图1）。

Fig.1 Effect of BC on hippocampal neuron apoptosis of Iso exposure rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=10.＊＊P<0.01，compared with normal control group；＃P<0.05，compared with Iso group；△P<0.05，compared with Iso+BC 100 mg·kg-1group.

2.3 BC对Iso暴露大鼠海马神经细胞ROS水平和MDA含量的影响

Iso组大鼠海马组织中MDA含量和海马神经细胞内ROS的水平明显高于正常对照组（P<0.01）；与Iso组相比，Iso+BC 100和200 mg·kg-1组大鼠海马组织中MDA含量及海马神经细胞内ROS水平明显减少（P<0.05），且Iso+BC 200 mg·kg-1组对ROS的抑制作用强于Iso+BC 100 mg·kg-1组（P<0.05）（图2）。

2.4 BC对Iso暴露大鼠海马神经细胞Ca2+浓度和MMP的影响

实验结果如图3所示，Iso组大鼠海马神经细胞内游离Ca2+浓度明显高于正常对照组（P<0.01），Iso+BC 100和200 mg·kg-1组大鼠海马神经细胞内游离Ca2+浓度较Iso组减少（P<0.05），Iso+BC 200 mg·kg-1组低于Iso+BC 100 mg·kg-1组（P<0.05）（图3A）。与正常对照组相比，Iso组大鼠海马神经细胞MMP明显降低（P<0.05），Iso+BC 100和200 mg·kg-1组大鼠海马神经细胞MMP明显高于Iso组（P<0.05），且Iso+BC 200 mg·kg-1组高于Iso+BC 100 mg·kg-1组（P<0.05）（图3B）。

Fig.3 Effect of BC on Ca2+concentration（A）and mito⁃chondrial membrane potential（MMP，B） in hippo⁃campal neurons of Iso exposuer rats.See Tab.1 for the rat treatment.FI：fluorescence intensity.±s，n=10.＊＊P<0.01，compared with normal control group；＃P<0.05，compare with Iso group；△P<0.05，compared with Iso+BC 100 mg·kg-1group.

2.5 BC对Iso暴露大鼠学习记忆的影响

与正常对照组相比，Iso组大鼠训练第4天逃避潜伏期明显延长（P<0.01），穿越平台次数明显减少（P<0.01），平台探索时间明显缩短（P<0.01）；与Iso组相比，Iso+BC 100和200 mg·kg-1组大鼠训练第4天逃避潜伏期均明显缩短（P<0.05），穿越平台次数明显增加（P<0.05），平台探索时间明显延长（P<0.05）；Iso+BC 100 mg·kg-1组与Iso+BC 200 mg·kg-1组间上述指标未见明显差异（图4）。

Fig.4 Effect of BC on learning and memory behavior in Morris water maze test in Iso exposure rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=10.＊＊P<0.01，compared with normal control group；＃P<0.05，compared with Iso group.

3 讨论

大量研究表明，Iso易导致神经损伤或认知障碍［7］，但影响神经系统的机制尚不明确。本研究结果显示，Iso暴露可引起大鼠海马组织中MDA和神经细胞中ROS水平明显升高，胞内钙超载和神经细胞MMP明显降低，进而促进大鼠海马神经细胞凋亡；而BC预处理能改善Iso暴露诱导的发育期大鼠海马神经细胞氧化损伤，稳定MMP，进而减少大鼠海马神经细胞凋亡。Zhao等［8］报道，Iso可增加海马神经细胞内Ca2+浓度，诱导神经毒性。细胞内Ca2+升高是细胞损伤的较早期事件，Iso通过下调N-甲基-D-天冬氨酸受体或过度激活γ-氨基丁酸受体可能导致Ca2+过多进入，引起线粒体超载，线粒体膜电位去极化，胱天蛋白酶激活，导致神经细胞凋亡［9］。研究表明，氧化应激与脑神经损伤密切相关［10］，过量的ROS可以引起细胞内Bax/Bcl-2比例失调，激活胱天蛋白酶3，引起细胞凋亡［11］。Iso引起的细胞内ROS蓄积是其产生神经毒性的原因之一。

本研究应用Morris水迷宫实验检测Iso暴露及BC干预对发育期大鼠远期学习记忆能力的影响。据文献报道，性激素水平影响大鼠水迷宫实验反应性和敏感性［12］。本研究选择雌雄各半大鼠，以排除激素水平对实验结果的影响。结果发现，与正常对照组比较，Iso组大鼠潜伏期明显延长，穿越平台次数和平台象限探索时间明显减少，表明Iso暴露可损伤发育期大鼠远期学习记忆能力，该结果与Jevtovic-Todorovic 等［13］和 Stratmann 等［14］的研究结果一致。本研究同时发现，Iso暴露前给予BC 100和200 mg·kg-1可使大鼠潜伏期明显缩短，穿越平台次数明显增多，表明BC对Iso暴露诱导的发育期大鼠神经细胞毒性具有保护作用，能有效改善Iso暴露诱导的发育期大鼠空间记忆功能障碍。

本研究结果表明，BC在受试剂量下对Iso暴露诱导的发育期大鼠神经细胞毒性有保护作用，但其在其他给药时间、给药途径及剂量下的作用有待进一步系统研究。

综上所述，BC对Iso诱导的发育期大鼠海马神经细胞损伤具有保护作用，表现为BC预处理能够抑制Iso暴露诱导的发育期大鼠海马神经细胞凋亡和氧化损伤，并能够改善Iso暴露诱导的发育期大鼠学习记忆功能障碍。