芪仙通络方及其拆方对脑梗死大鼠神经功能及神经营养因子表达的影响*

周胜强 李 博 王 琦 周春吉 刘 芳 邓奕辉

（1.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；4.南华大学第一附属医院，湖南 衡阳421001）

脑梗死急性期时间窗内静脉溶栓、机械取栓是目前西医治疗本病的有效方法，但此方法存在治疗时间窗窄、出血风险高等缺点，临床获益者不到5%［1］。对于遗留肢体瘫痪、麻木等神经功能障碍的患者，仍然缺乏安全、高效的治疗措施，是目前医学界亟待解决的难点［2］。而传统中医药对于本病的防治积累了丰富的经验，具有独特的优势，有望为本病的干预开辟新的途径［3］。芪仙通络方系国医大师刘祖贻教授根据其“气阳主用”脑病创新理论研制成的中风病效验方［4］，主要针对中风病肾虚血瘀证，在补肾填精、活血通络的基础上加以温补肾中阳气，经多年临床实践证实有效性和安全性确切［5-6］。本研究旨在通过动物实验，比较芪仙通络方及其拆方对脑梗死大鼠神经功能、梗死周边区域缺血损伤神经元及神经纤维病理形态以及神经营养因子表达影响的差异，探讨芪仙通络方组方配伍的意义，以期佐证“气阳主用”创新理论的临床指导价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠，体质量（240±30）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。饲养于湖南省中医药研究院SPF级实验动物中心。饲养环境温度（24±0.5）℃，相对湿度50%，自由饮食进水，昼夜光照节律。适应性喂养1周后用于实验。

1.2 药物与试剂 芪仙通络方：黄芪30 g，淫羊藿15 g，枸杞子30 g，制首乌 15 g，丹参30 g，葛根 30 g，水蛭9 g，山楂15 g组成。补肾活血拆方：枸杞子30 g，制首乌15 g，丹参30 g，葛根 30 g，水蛭9 g，山楂15 g组成。益气温阳拆方：黄芪30 g，淫羊藿15 g。中药饮片均购自湖南省中医药研究院附属医院，由药剂科田其学主任药师鉴定为正品，符合2015年版《中国药典》规范。芪仙通络方水煎后浓缩成生药质量浓度1.566 g/mL，补肾活血拆方水煎浓缩成1.161 g/mL，益气温阳拆方水煎浓缩成0.405 g/mL，4℃冰箱保存备用。胞磷胆碱钠胶囊（齐鲁制药有限公司，0.1 g×40粒/盒，国药准字H20020220）生理盐水溶解后稀释成0.0054 g/mL的水溶液备用。甘氨酸银染液套装（Servicebio，货号G1052）；Anti-BDNF Rabbit pAb（Servicebio，货号 GB11559）；Anti-GDNF Rabbit pAb（Servicebio，货号 GB11403）；Anti-NGF Rabbit pAb（Servicebio，货号GB11143）；HRP标记山羊抗兔（Servicebio，货号GB23301）；免疫组化试剂盒（Servicebio，货号G1215）；尼氏体染色液（Servicebio，货号G1036）。

1.3 主要仪器 大脑中动脉栓塞（MCAO）线栓（广州佳灵生物技术有限公司，规格3600AAA）；组织脱水机（武汉俊杰电子有限公司，型号JJ-12J）；石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号JB-P5）；石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016）；组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-P）；微波炉（格兰仕微波炉电器有限公司，型号P70D20TLP4）；正置光学显微镜（日本尼康，型号NIKON ECLIPSE E100）。

1.4 造模方法 参照课题组前期研究方法［7］，采用线栓法复制大鼠MCAO模型。大鼠造模前12 h禁食，不禁水。将大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后仰卧位固定于手术操作台上，取颈部正中切口，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。结扎颈总动脉、颈外动脉。动脉夹夹闭颈内动脉，于颈总动脉上端近分叉处约4 mm处用注射器针头刺一小孔，将直径为0.28 mm的线栓插入颈内动脉，插入深度由分叉部计约18.0 mm，固定线栓，依次关闭切口。假手术组切开皮肤，暴露颈总、颈外和颈内动脉，不插入线栓，其余步骤和手术组相同。大鼠清醒后，采用Longa评分法评定神经功能［8］，评分越高，神经功能缺损越严重，选取1～3分者纳入实验，死亡大鼠予以随机替补。

1.5 分组与给药 将30只造模成功的大鼠按随机数字表法随机分为模型组、芪仙通络全方组（补肾活血、益气温阳药）、拆方1组（补肾活血药）、拆方2组（益气温阳药）、胞磷胆碱组，每组6只。另设假手术组6只。于MCAO术后第3天开始灌胃干预，芪仙通络全方组给药剂量为15.66 g/（kg·d），拆方1组为11.61 g/（kg·d），拆方2组为4.05 g/（kg·d），胞磷胆碱组为0.054 g/（kg·d），假手术组和模型组予以蒸馏水灌胃，连续给药12 d。

1.6 标本采集与检测 各组大鼠在末次灌胃后4 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔暴露心脏，剪开右心耳，同时夹闭腹主动脉，将注射器针头经心尖插入至主动脉端并固定好，用100 mL生理盐水通过注射器快速注入，待心脏无血污流出及前爪、肺部颜色变成白色后，改用100 mL 4%多聚甲醛灌注，然后开颅取脑，去除小脑、脑干及嗅球后，将大脑置于4%多聚甲醛中固定，4℃冰箱保存，用于尼氏染色、镀银染色和免疫组化检测。1）神经功能评价。分别于造模后第3天、第7天、第14天采用改良神经功能缺损评分（mNSS）［9］评定大鼠的神经功能，对大鼠的运动、感觉、反射和平衡能力进行全面评价，总分为18分，分值越高代表神经功能缺损越严重。2）神经元及神经纤维病理形态观察。于造模后第14天通过尼氏染色检测神经元尼氏小体含量，观察梗死周边区域神经元病理形态改变，通过镀银染色观察神经纤维病理形态改变。脑组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋，4 μm连续冠状切片，60℃烤片2 h后常规脱蜡至水，然后将脑组织切片放入尼氏体染色液染色2～5 min或甘氨酸银染液中染色8～10 min，脱水后，中性树胶封片。每张切片在光学显微镜下高倍镜视野（400倍）观察梗死周边区域，每只大鼠分别随机取1张切片，每张切片观察5个视野，拍照采集图像，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算单位面积尼氏小体或神经纤维积分光密度，取平均光密度（MOD）值对尼氏小体或神经纤维进行病理形态定量分析。3）脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经生长因子（NGF）表达检测。于造模后第14天通过免疫组化检测梗死周边区域神经营养因子BDNF、GDNF、NGF表达水平。将常规脱蜡至水的脑组织切片，置于EDTA（PH9.0）抗原修复液中进行抗原修复20 min，放入3%双氧水溶液室温避光孵育25 min，滴加3%BSA室温封闭30 min，加入Anti-BDNF Rabbit pAb（1∶200）、Anti-GDNF Rabbit pAb（1∶200）、Anti-NGF Rabbit pAb（1∶200），4 ℃冰箱孵育过夜，滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记），室温孵育50 min，DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水后中性树胶封片。每张切片在光学显微镜下高倍镜视野（400倍）观察梗死周边区域，每只大鼠随机取1张切片，每张切片观察5个视野，拍照采集图像，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算神经纤维MOD值，进行病理形态定量分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠MCAO术后不同时间点mNSS比较 见表1。大鼠脑梗死造模后，模型组mNSS明显升高，经芪仙通络方及其拆方、阳性药胞磷胆碱干预后，各给药组（第7天、第14天）mNSS均明显低于模型组（P＜0.01），而分别与拆方1组、拆方2组及胞磷胆碱组比较，芪仙通络全方组（第7天、第14天）mNSS显著降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠MCAO术后不同时间点mNSS比较（分，±s）

表1 各组大鼠MCAO术后不同时间点mNSS比较（分，±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01；与芪仙通络全方组比较，△P＜0.05。下同。

组别n 3 d 7 d 14 d假手术组模型组芪仙通络全方组拆方1组拆方2组胞磷胆碱组6 6 6 6 6 6 0.00±0.00 9.52±0.43 9.46±0.32 9.37±0.38 9.46±0.27 9.54±0.22 0.00±0.00 8.95±0.21 6.47±0.28**7.07±0.26**△7.98±0.32**△8.07±0.13**△0.00±0.00 6.91±0.38 4.36±0.19**5.32±0.37**△6.05±0.24**△6.11±0.52**△

2.2 各组大鼠梗死周边区域神经元及神经纤维病理形态比较 如图1、表2所示，尼氏染色可见假手术组神经元结构清晰，胞浆内分布有深蓝色片状的尼氏小体，以胞浆周边分布最为密集。模型组梗死周边区域神经元结构模糊，尼氏小体含量明显减少，以细小颗粒为主，着色不均。各给药组梗死周边区域尼氏小体的含量均有不同程度的增加，胞浆着色较深。经定量分析，尼氏小体MOD值均明显高于模型组（P＜0.01），而与拆方1组、拆方2组及胞磷胆碱组分别比较，芪仙通络全方组尼氏小体MOD值最高（P＜0.05）。如图2、表2所示，镀银染色可见假手术组神经纤维形态完整，分布密集，排列有序，距离较长，呈黑色，背景金黄色；模型组梗死周边区域可见大量神经纤维断裂，结构破坏，散乱无章，参差不齐，弯曲收缩球形，仅极少数保持连续完整；各给药组梗死周边区域神经纤维均有不同程度的芽生修复，经定量分析，神经纤维MOD值均明显高于模型组（P＜0.01），而与拆方1组、拆方2组及胞磷胆碱组分别比较，芪仙通络全方组神经纤维MOD值最高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠梗死周边神经元及神经纤维病理形态比较（±s）

表2 各组大鼠梗死周边神经元及神经纤维病理形态比较（±s）

组别假手术组模型组芪仙通络全方组拆方1组拆方2组胞磷胆碱组n 6 6 6 6 6 6尼氏小体0.016±0.005 0.004±0.001 0.014±0.006**0.010±0.002**△0.007±0.003**△0.005±0.001**△神经纤维0.187±0.012 0.109±0.017 0.167±0.011**0.145±0.018**△0.131±0.012**△0.133±0.014**△

图1 各组大鼠脑梗死周边神经元病理形态（尼氏染色，400倍）

图2 各组大鼠脑梗死周边神经纤维病理形态（镀银染色，400倍）

2.3 各组大鼠梗死周边神经营养因子表达比较 如图3、表3所示，BDNF、GDNF及NGF主要表达位于细胞间质及细胞质，呈棕黄色，细胞核为蓝色；假手术组可见BDNF、GDNF及NGF一定量表达，模型组表达稍增加；与模型组比较，各给药组BDNF、GDNF及NGF表达均显著增加（P＜0.01）；与拆方1组、拆方2组及胞磷胆碱组分别比较，芪仙通络全方组BDNF、GDNF及NGF表达增加程度最显著（P＜0.05）。

表3 各组大鼠梗死周边神经营养因子表达比较（±s）

表3 各组大鼠梗死周边神经营养因子表达比较（±s）

组别假手术组模型组芪仙通络全方组拆方1组拆方2组胞磷胆碱组n 6 6 6 6 6 6 BDNF 0.008±0.002 0.012±0.003 0.018±0.004**0.016±0.002**△0.014±0.003**△0.014±0.001**△GDNF 0.009±0.002 0.011±0.003 0.019±0.003**0.015±0.001**△0.012±0.002**△0.013±0.001**△NGF 0.002±0.000 0.004±0.001 0.015±0.002*0.010±0.001**△0.007±0.002**△0.008±0.003**△

图3 各组大鼠脑梗死周边神经营养因子表达（IHC染色，400倍）

3 讨 论

芪仙通络方由黄芪、淫羊藿、制首乌、枸杞子、丹参等药组成。方中黄芪为君药，大补元气；淫羊藿、制首乌、枸杞子为臣药，淫羊藿佐君药黄芪益气温阳、温补肾中阳气，配伍制首乌、枸杞子补肾填精，达到助阳生阴之用；丹参等活血通络为佐药。诸药合用，共奏益气温阳、补肾活血之功。经查阅文献发现，目前针对脑梗死肾虚血瘀证的治疗，广大医家大多采用单纯补肾填精、活血通络法或补肾益气活血法或补肾活血基础上加以附子、干姜等刚猛的温阳药治疗［10-13］，而在补肾填精、活血通络药的基础上，加以柔和的益气温阳药、意在少火生气者则未见报道。课题组前期临床研究表明，芪仙通络方能显著改善脑梗死恢复及后遗症期患者的神经功能，提高其日常生活活动能力，改善肾虚血瘀证中医证候，且未见任何不良反应发生［5］。实验研究证实，本方能显著促进MCAO大鼠神经功能恢复，上调缺血海马区BDNF表达，抑制胶质细胞过度活化，促进内源性神经再生［7］。结果说明“气阳主用”脑病创新理论指导下的芪仙通络方在治疗脑梗死后神经功能障碍方面优势明显，组方配伍独特，临床实用性较强。

国际脑卒中治疗临床前研究指南指出，多重指标综合评价MCAO模型很重要，组织学和行为学的结果都应该评价［14］。首先在行为学层面，由于大脑中动脉供血的区域包括额顶颞叶皮质、边缘系统、丘脑、单侧豆状核及内囊，依据缺血部位及程度的不同，可表现为运动、感觉、反射、平衡或认知功能受损。而目前广泛采用的动物行为学评价主要有Longa评分法［8］和Bederson分级法［15］。这些评分法虽然操作简便，但相对较为粗糙、主观，仅评价运动功能，有其局限性。而mNSS包括运动、感觉、反射和平衡4项测试，能够较全面反映脑损伤及恢复的程度。其次在组织学层面，尼氏小体是神经元活性的指标，由粗面内质网及游离核糖核蛋白体共同构成，主要功能是合成蛋白质。生理情况下，尼氏小体的数量可反映神经细胞合成蛋白质的能力，而当神经元受损等病理状态下，胞质内的尼氏小体可溶解、减少或消失，如细胞不死亡，则尼氏小体可逐步恢复。因此通过尼氏小体染色密度大小和深浅可以反映神经元的功能状态［16］。镀银染色又称甘氨酸银染色，能将神经细胞轴突和树突、神经细胞内原纤维等染成黑色，切片的其他组织及背景呈现金黄色，常用于研究神经纤维的病理改变，可用来了解神经纤维变性或修复程度［17］。本实验发现，造模后脑梗死大鼠肢体运动、感觉、平衡等神经功能均受损，梗死周边组织出现明显的缺血损伤病理改变，而芪仙通络方及其补肾活血药拆方、益气温阳药拆方以及胞磷胆碱干预均可使其病理形态发生逆转，梗死周边区域神经元尼氏小体含量增多，神经纤维均有不同程度的芽生修复，其中又以补肾活血、益气温阳立法的芪仙通络全方组作用最明显，提示补肾活血药与益气温阳药配伍使用，可产生协同作用，间接佐证了“气阳主用”创新理论对于治疗脑梗死后神经功能障碍具有的重要临床指导价值。

神经营养因子是由多种细胞分泌的一类对外周和中枢发挥营养作用的物质，促进和支持靶细胞的生长、分化、修复和存活，调节神经系统的代谢和功能。BDNF、GDNF以及NGF是神经营养因子家族的重要成员，是脑内重要的神经修复促进因子，在脑缺血损伤修复过程中能够在突触水平、轴突水平和细胞水平上调节神经的再生重塑［18］。本研究显示，假手术组可见BDNF、GDNF及NGF一定量表达，模型组表达稍增加，而各给药组表达均较模型组明显增加，其中芪仙通络全方组表达增加程度最显著，表明芪仙通络方及其拆方均能显著促进脑梗死大鼠梗死周边区域神经营养因子BDNF、GDNF、NGF蛋白表达，其中芪仙通络全方作用优于单纯补肾活血药和益气温阳药，提示脑缺血后大鼠脑组织可反应性增加梗死周边组织神经营养因子BDNF、GDNF、NGF的合成和分泌，但这种能力非常有限，而芪仙通络方全方较拆方更能显著上调这种趋势。因此，通过调节神经营养因子表达可能是芪仙通络方及其拆方修复缺血损伤神经元及神经纤维、改善受损神经功能的分子机制。

综上所述，本研究从动物整体水平证实了芪仙通络方及其拆方治疗脑梗死后神经功能障碍的疗效，同时初步揭示了其分子机制，并为中医药运用“气阳主用”脑病创新理论治疗中风病提供了实验证据。然而，梗死周边区域病理形态的改善是否是由于神经元自身修复或再生或轴突-髓鞘重塑则有待进一步深入研究。