山楂、猴头菇功能饮料中总多糖提取工艺研究

门志雯，崔佰吉，苏琳婷，李松岩，孙海宁，肖 雯，欧阳静，沈 楠*，刘庆波 (.吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 3203；2.吉林省吉林中西医结合医院，吉林 吉林 3202)

山楂是药食两用水果，富含黄酮类、多糖、有机酸等成分，可促进消化、开胃健脾，具有降血压、降血脂、抗菌、抗癌等作用[1]，被广泛应用于食品及医药保健品领域[2]。猴头菇也被称为猴头菌，营养丰富[3]，既可入药也可食用[4],具有促进消化、抗氧化、调养身体作用[5],还可润肠通便、滋阴养肾、健脾养胃[6]。本研究预采用山楂和猴头菇作为原料，以总多糖为基础原料，经过发酵工艺制备一种复合性功能饮料。由于发酵工艺对多糖的含量变化具有一定的影响，为保证后续工作能够顺利进行，本研究采用单因素结合响应面设计的方法优化山楂、猴头菇总多糖的提取工艺，为山楂、猴头菇功能饮料的开发提供参考。

1 仪器与试剂

UV-1800紫外分光光度计(日本岛津)；FA224电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；WHY-2恒温培养振荡器(常州金坛中旺仪器制造有限公司)；TD4实验资料C台式低速离心机(盐城市凯特实验仪器有限公司)；Scientz-12SN冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

猴头菇子实体购自杭州众芝康菇生物技术有限公司；山楂购自隆盛果业种植基地；葡萄糖(20200312)购自天津渤化化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 总糖含量的测定方法

2.1.1 标准曲线的测定

总糖的含量测定以葡萄糖为基准物质，硫酸-苯酚显色法进行测定。取葡萄糖适量，加水溶解，配置成葡萄糖浓度为0.016 g/L的标准储备液。分别精密吸取储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置5 mL量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。精密吸取各标准品溶液2 mL置试管中，分别加入6%苯酚溶液1.2 mL，硫酸6.5 mL，混匀后充分反应60 min，在490 nm波长下测定吸光度，以葡萄糖浓度和吸光度做标准曲线。回归方程为：y=49.4x-0.043，R2=0.999 0，线性关系良好，可用于测定待测物质中总糖的含量。

2.1.2 样品总多糖的含量测定

取制备好的样品溶液2 mL置试管中，加入6%苯酚溶液1.2 mL，混匀，加入硫酸6.5 mL，混匀后充分反应60 min，在490 nm波长下测定吸光度，吸光度带入标准曲线，计算总多糖的含量。

2.2 多糖的提取

山楂和猴头菇分别切成小块，置于恒温鼓风干燥箱中干燥3 h，粉碎，过40目筛。称取山楂粗粉和猴头菇粗粉各10 g，置三角瓶中，加入一定比例的蒸馏水，在恒温水浴锅中加热提取，提取液过滤，重复三次提取，合并提取液，减压浓缩提取液，冷冻干燥即得总多糖。

2.3 多糖的提取工艺优化

2.3.1 提取料液比例考察

固定提取温度60 ℃、时间45 min，测定不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，按照“2.2”项下方法提取，按照“2.1.2”项下方法进行多糖的含量测定。结果表明，总多糖的提取量随着提取溶剂的增加而增加，且多糖含量在1∶20条件下达到峰值，增加料液比例后，多糖含量增加的效果不明显，所以选择最佳的料液比例为1∶20进行后续的实验设计。

2.3.2 提取时间考察

按照“2.3.2”项下各自的最佳料液比、温度60 ℃，分别采用45、60、90、120、150 min，考察提取时间对多糖含量的影响。按照“2.2”项下方法提取，按照“2.1.2”项下方法进行多糖的含量测定。结果表明，随着提取时间的增加，多糖的含量也随之增加，但是增加的幅度不是很大，最后选择最佳提取时间为90 min。

2.3.3 提取温度的考察

按照“2.3.2”和“2.3.3”项下最佳的提取条件，分别采用50、60、70、80、90 ℃，按照“2.2”项下方法提取，按照“2.1.2”项下方法进行多糖的含量测定。结果表明，最佳提取温度为80 ℃。

2.3.4 响应面实验设计

通过单因素实验，初步确定最佳的料液比、提取温度、提取时间三个因素，根据单因素实验的最佳实验条件的基础上，分别选取不同的水平数，采用响应面设计，选取三个平行实验，因素水平表见表1，实验设计及结果见表2，方差分析结果见表3，置信区间及二项式拟合系数见表4，因素交互作用对多糖提取影响见图1、2。

表3可见,模型F值为7.23，表明模型显著。只有2.11%的可能性，P值小于0.05表示模型项显著,大于0.1表示模型项不显著。在这种情况下A、AB、BC、B是重要的模型项。整体模型设计合理，各因素显著性明显，可以用于本研究的数据分析及预测。同时各因素之间的相互作用对于提取的结果具有一定的影响性。

由表4，可以看出系数估计值表示在所有剩余因子保持不变时，每单位因子变化的响应的预期变化。在正交设计中，截距是所有运行的总体平均响应。这些系数是根据因素设置对平均值进行的调整。当因子正交时，VIF应为1。VIF大于1时表示为多共线，VIF越高，相关因素越严重。一般来说，低于10的VIFs是可信的，综合分析本模型的预测结果是可信的，模型设计是合理的。

表 1 因素水平表

表 2 响应面设计结果表

表 3 方差分析结果表

一般情况下植物中有效成分的提取受多个因素共同制约，本实验中多糖的提取不仅与所选的因素有直接关系，因素之间也存在着相互作用的关系。由图1的结果可以看出：B-C因素的交互作用对多糖的含量提取的影响作用最为明显，A-C因素见的交互作用影响最小。图2的坡度曲线也印证了2D结果图给出的信息，A-B,B-C的曲面图坡度均较大，A-C曲面度接近平面。说明因素间交互作用的影响和因素A，B单独作用是有着同等重要的作用。

图 1 因素交互作用对多糖提取影响2D图

图 2 因素交互作用对多糖提取影响3D图

预设最佳实验多糖含量为最高值的10倍，由软件分析后，得出最佳实验方案的32种预测方案，根据给出的最佳方案的设计可以看出，最佳实验方案为A=1,B=-0.8,C=-1。

2.3.5 工艺验证

分别按照山楂多糖、猴头菇多糖的最佳提取工艺，即：料液比1∶25，提取时间66 min，提取温度70 ℃。按照“2.2”项下方法提取，按照“2.1.2”项下方法进行多糖的含量测定，平行提取3份，进行工艺验证。验证结果SD为1.16，可以看出实际结果与预测结果吻合，方法重复性良好，工艺稳定。

3 讨 论

本研究用响应面设计进行了山楂、猴头菇功能饮料中总多糖的提取最佳工艺的研究。研究表明二者多糖的提取过程中料液比是影响其提取率的主要因素。虽然料液比例的加大有利于多糖的提取，但是随着多糖被提取完全，为保证后续工作顺利进行，选择最佳的比例比较重要。同时各因素之间的交互作用也比较明显，且影响程度比较大。实验过程中还发现由于山楂本身含有多酸性物质，体系的pH值的变化也有可能引起多糖提取量的变化，但不显著。但其变化是否引起多糖种类的变化还有待进一步验证。