铁死亡参与阿霉素诱导的小鼠局灶节段性肾小球硬化

于晓霞 王洪梅 朱虹 吴华 郑明楠 朴明姬 边艳 高弼虎

大连大学附属中山医院肾内科，辽宁 116001

细胞死亡是一种多途径多模式过程。目前认为，除细胞坏死外，凋亡、自噬、焦亡和胀亡等是细胞死亡的主要方式。近年来，铁死亡作为一种新型程序性细胞死亡方式逐渐成为新的研究热点。

实验证实，多种重大慢性疾病如肾癌、胰腺癌、帕金森综合征以及心肌病等发生发展过程中均有铁死亡现象［1］。Nie 等［2］观察到，利用索拉菲尼诱导铁死亡对肝细胞癌具有抑制作用，Ratan［3］通过干预铁死亡可以改善神经元损伤，这些结果均提示通过调控铁死亡对疾病可能有潜在治疗作用。而在肾脏病领域，也观察到铁死亡参与急性肾损伤［4］，但在局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomurular sclerosis，FSGS）中尚未见相关报道。因此，本研究拟通过注射阿霉素（ADR）建立FSGS 小鼠模型，并采用电子显微镜、生化试剂盒和荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）等方法检测FSGS 中是否存在铁死亡，为进一步揭示FSGS 发病机制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 健康SPF 级雄性BALB/c 小鼠40 只，7～8 周龄，体质量（21.00±2.35）g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。在大连大学附属中山医院动物实验中心饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（辽）2018-0005。小鼠完全随机设计分为对照组（20 只）、模型组（20 只）。实验过程中动物在饲养笼中常规饲养，可自由摄食和饮水，动物实验均依据《医学实验动物管理实施细则》的要求，经医院伦理委员会审批通过（编号为2021003），依照动物福利与伦理原则处理。

1.2 药物及试剂 ADR 注射粉剂购自北京索莱宝科技有限公司，批号：D8740。异氟烷购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：B2028066。戊巴比妥那购自美国Sigma公司，批 号：P3761。尿白蛋白/肌 酐（albumin to creatinine，ACR）检测试剂盒购自南京建成有限公司，批号：20200722。TRNzol 总RNA 提取试剂购自天根生化科技公司，批号：DP405。PCR 引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司。qRT-PCR 试剂盒购自Bimake 公司，批号：B21202。还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，批号：S0053。丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，批号：S0131M。

1.3 仪器 光学显微镜：日本Olympus 公司CX41；低温离心机：德国Sigma 公司8K；脱水机：武汉俊杰电子有限公司JJ-12J；包埋机：武汉俊杰电子有限公司JB-P5；病理切片机：上海徕卡仪器有限公司RM2016。PCR 仪：德国Eppendorf 公司5331；H-600 透射电镜：日本HIYACH 公司。酶标仪：美国Thermo 公司。7500 Real Time PCR 仪：美国Applied Biosystems公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制备及给药 模型组：一次性经眼球后注射ADR（13 mg/kg）建立实验FSGS 小鼠模型。对照组：眼球后注射与ADR同等剂量的生理盐水。

1.4.2 ACR 检测 分别于小鼠造模前1 d（0 周）及实验第1 周、第8 周末收集尿液，低速低温离心机中离心（4 000 r/min，4 min，4 ℃，离心半径为14 cm）去除沉渣，按试剂盒检测说明采用ELISA 法测定小鼠尿白蛋白和肌酐，计算ACR。

1.4.3 肾脏取材及病理学检查 第8 周末，小鼠麻醉后处死，分别取各组小鼠左侧2/3 肾脏，PBS 冲洗后去除包膜，经4%多聚甲醛固定24 h，75%～100%乙醇逐步脱水，浸蜡，石蜡包埋，连续切片（厚度2 μm），行过碘酸雪夫染色（periodic acid-schiff stain，PAS），光镜观察肾组织形态学改变。各组小鼠剩余左侧1/3 肾脏，PBS 冲洗后去除包膜，切成约1 mm2小块，2.5%戊二醛固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，透射电镜观察足细胞形态及超微结构。

1.4.4 肾组织GSH 和MDA 检测 取小鼠新鲜右侧肾脏组织，称重后按1∶9的比例加入冷生理盐水后进行均浆5 min，制成10% 均浆液，低温离心机，3 000 r/min 离心10 min，4 ℃，离心半径为14 cm），取上清液按试剂盒要求用酶标仪测量GSH和MDA浓度。

1.4.5 应用qRT-PCR 测量小鼠肾组织PTGS2 mRNA水平 应用Trizol 提取肾组织总RNA，检测RNA的浓度及纯度。按照RNA 反转录试剂盒说明书，将RNA 反转录成cDNA，按照荧光定量RT-PCR 试剂盒说明书操作，检测肾组织PTGS2 mRNA 表达，以GAPDH 作为内参。所用PCR引物如下，PTGS2：正向引物为5’-TGGAGGCGAAGTGGGTTTTA-3’，反向引物为5’-GAGTGGGAGGCACTTGCATT-3’；GAPDH：正向引物为5’-GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA-3’，反向引物为5’-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3’。

1.5 统计学方法 所有数据采用统计软件SPSS Statistics 17.0进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，组间数据比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ACR 变化 两组小鼠造模前ACR 比较差异无统计学意义（P＞0.05），造模后第1 周及第8 周，模型组小鼠ACR水平均显著高于对照组（均P＜0.001），见表1。

表1 两组小鼠造模前、造模后第1周与第8周ACR比较（mg/mg)

表1 两组小鼠造模前、造模后第1周与第8周ACR比较（mg/mg)

注：模型组一次性经眼球后注射ADR（13 mg/kg）建立实验FSGS 小鼠模型，对照组眼球后注射与ADR 同等剂量的生理盐水；ACR 为尿白蛋白/肌酐，ADR 为阿霉素，FSGS 为局灶节段性肾小球硬化

2.2 肾组织病理形态学观察 对照组小鼠肾小球及间质小管均未见明显异常（见图1A、B）。模型组小鼠第8周末可见弥漫肾小球系膜细胞及系膜基质增多，肾小球局灶、节段性硬化（黑色箭头），肾间质可见炎细胞浸润，肾小管上皮细胞空泡变性，部分肾小管上皮细胞脱落，管腔中大量蛋白管型（见图1C、D）。

图1 两组小鼠肾组织PAS染色比较（A为对照组×100；B为对照组×400；C为模型组×100；D为模型组×400）

2.3 足细胞线粒体超微结构观察 对照组小鼠足细胞线粒体结构未见明显异常（见图2A），而模型组小鼠足细胞可见线粒体萎缩（黑色箭头），线粒体嵴减少和线粒体膜破裂（红色箭头）等典型铁死亡的线粒体形态学改变（见图2B）。

图2 两组小鼠足细胞线粒体超微结构改变（A为对照组，B为模型组）

2.4 肾组织GSH 和MDA 浓度变化 与对照组比较，模型组小鼠肾组织GSH 浓度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.001）；而模型组小鼠肾组织MDA 水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表2。

表2 两组小鼠肾组织GSH和MDA浓度比较（mmol/L）

表2 两组小鼠肾组织GSH和MDA浓度比较（mmol/L）

注：模型组一次性经眼球后注射ADR（13 mg/kg）建立实验FSGS 小鼠模型，对照组眼球后注射与ADR 同等剂量的生理盐水；MDA 为丙二醛，GSH 为谷胱甘肽，ADR 为阿霉素，FSGS 为局灶节段性肾小球硬化

2.5 肾组织PTGS2 mRNA 表达水平 对照组小鼠肾组织中铁死亡标志物PTGS2 mRNA 水平为（1.34±1.61），模型组为（5.94±3.51），模型组PTGS2 mRNA 表达水平显著增高，差异有统计学意义（t=5.327，P＜0.001）。

3 讨 论

铁死亡是2012 年由Dixon 等［5］命名的一种新型细胞死亡方式，其主要特征是铁依赖性的细胞内脂质过氧化物和活性氧簇蓄积［6］。目前研究证实，在肾细胞癌、乳腺癌、阿尔茨海默病以及心肌病等疾病中均发现铁死亡现象［7-10］。但在FSGS 中尚未见相关报道，因此本研究主要观察FSGS模型中是否有铁死亡发生。

本实验首先通过眼球后注射ADR 建立FSGS 小鼠模型，这也是目前实验研究较常用的FSGS造模方式。ADR是环蒽类抗生素，可同时抑制细胞DNA 及RNA 合成，对肾小球脏层上皮细胞、毛细血管内皮细胞及肾小管上皮细胞均有明显毒性损伤，最终导致FSGS［11］。本实验给予ADR注射后，小鼠表现为大量蛋白尿，肾组织PAS 染色呈现典型的FSGS病理形态学改变，提示造模成功。

建立FSGS 小鼠模型后，我们进一步探索FSGS 中是否有铁死亡。既往文献报道，铁死亡不具有细胞皱缩、染色质凝集和凋亡小体形成等传统细胞凋亡的形态学特征，但用电子显微镜可以观察到线粒体皱缩和双层膜密度增加等特征性改变［12］。我们的研究也观察到，FSGS 模型小鼠足细胞线粒体萎缩，线粒体嵴减少以及线粒体膜破裂等改变，提示FSGS 足细胞线粒体具有铁死亡的特征性形态学改变。目前研究证实，GSH 耗竭以及脂质过氧化物蓄积均是铁死亡的特征改变［13］，GSH 减少会影响谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低细胞抗氧化能力，致使脂质过氧化反应增加，脂质活性氧增多，引起铁死亡［14］。本文研究结果显示，FSGS 模型小鼠肾组织中GSH 浓度显著降低，而脂质过氧化产物MDA 浓度显著增加，表明FSGS 中可能存在铁死亡。为验证这个结果，我们进一步对铁死亡标志基因PTGS2 mRNA［15］的表达进行检测。结果显示，FSGS 模型小鼠肾组织PTGS2 mRNA 表达水平显著增高，与文献报道一致，证实FSGS中存在铁死亡。

综上所述，本研究发现FSGS 小鼠模型中存在铁死亡，让我们对FSGS 发病机制有了新的认识和理解，也为FSGS新药开发提供了新视角。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。