超高效液相色谱-串联质谱法测定东北红豆杉中7种黄酮的含量

彭波，李洪权，柏玉冰*（.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 40007；.株洲市食品药品检验所，湖南 株洲4000）

东北红豆杉（Taxus cuspidataSieb.et Zucc.）又名紫杉，是红豆杉科红豆杉属植物[1]，在我国主要分布于长白山系[2]。成分研究表明东北红豆杉含有紫杉烷、黄酮、甾体、木质素[3]等成分；药理活性研究表明东北红豆杉有抗肿瘤[4-5]、降血糖[6]、抗氧化[7]等药理作用。

目前，关于东北红豆杉的研究大多围绕其紫杉烷类成分的抗肿瘤活性[8-9]。但还有研究表明其黄酮类成分也有很好的生物活性[10-11]，如槲皮素[12]、山柰酚[13]和芦丁[14]的抗肿瘤活性，银杏双黄酮对高糖致微血管内皮细胞炎症反应的保护作用[15]，金松双黄酮对尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶的抑制作用[16]，二氢槲皮素的心脏保护作用[17]以及二氢山柰酚对脂质沉积的抑制作用[18]等。

基于这些黄酮类功效成分对东北红豆杉进行质量评价，对其建立含量测定方法则显得尤为重要。Gai 等[19]测定了金松双黄酮、银杏双黄酮和槲皮素成分的含量。目前尚未发现山柰酚、二氢槲皮素、二氢山柰酚和芦丁4 种成分含量测定的相关报道，更未发现对这7 种成分同时测定的相关报道。

目前中药材中黄酮类成分的含量测定方法有比色法、薄层色谱法、紫外可见分光光度法、高效液相色谱法及液相色谱-串联质谱法等[20]。而鉴于本法测定成分多达7 种，对检测效率和准确性的要求均较高，超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）具有基于质荷比分析而几乎不依赖于各峰之间的分离度（同分异构体除外），分析时间短，灵敏度高等特点[21]。本研究基于UHPLC-MS/MS 法建立东北红豆杉中7 种黄酮成分的含量测定方法，以期为基于黄酮类成分对东北红豆杉进行质量评价提供技术帮助。

1 材料

1.1 药材

东北红豆杉，获取途径为自采、网购和药材市场采购，样品信息见表1。所有批次药材经株洲市食品药品检验所胡冠宇主管药师鉴定均为红豆杉科红豆杉属植物东北红豆杉的带叶枝条或全株。所有批次药材（全株则剪取带叶枝条）均经粉碎后过4 号筛，备用。

表1 东北红豆杉样品信息Tab 1 Information of Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.samples

1.2 试药

银杏双黄酮（纯度：98.0%，批号：PRF911 0505）、金松双黄酮（纯度：98.0%，批号：PRF 9110541）、二氢槲皮素（纯度：98.0%，批号：BP1367）和二氢山柰酚（纯度：98.0%，批号：SBP00122）（对照品，成都普瑞法科技开发有限公司）；槲皮素（纯度：97.4%，批号：100081-200907）、山柰酚（纯度：95.9%，批号：110861-200808）和芦丁（纯度：90.5%，批号：100080-200707）（对照品，中国食品药品检定研究院）。甲酸、乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙腈、甲醇（色谱纯，霍尼韦尔有限公司）。

1.3 仪器

电子天平（XSE 205DV，0.01 mg，梅特勒托利多仪器有限公司）；超声波仪（HNS-SY-150，40 kHz，400 W，北京恒奥德仪器仪表有限公司）；Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；QTRAP 4500 三重四极杆质谱（上海爱博才思分析仪器有限公司）等。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 色谱条件 采用Welch Xtimate C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，以水（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0～6 min，90%→65%A；6～8 min，65%→45%A；8 ～14.5 min，45%→30%A；14.5 ～20 min，30%A →10%A；20 ～20.5 min，10%→90%A；20.5 ～22 min，90%A）， 流速0.8 mL·min－1，采集时间22 min，柱温30℃，进样量2 μL。

2.1.2 质谱条件 电离源：电喷雾电离源（ESI）；离子模式：通过比较正、负离子模式下各成分分子离子峰信号强度，选择负离子模式；扫描模式：多反应监测（MRM）；离子源温度、电喷雾电压、气帘气及离子源气等参数则选择仪器默认参数，其中离子源温度为550 ℃，电喷雾电压为－4500 V，气帘气为35.0 psi，离子源气1 为55 psi，离子源气2 为55 psi；去簇电压和碰撞能量，根据信号强度曲线，选择各成分分子离子峰信号最强时所显示数值，详见表2。

表2 7 种黄酮的保留时间及质谱参数Tab 2 Retention time and UHPLC-MS/MS parameters of the 7 flavones

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品储备溶液 精密称取不同质量的银杏双黄酮、金松双黄酮、槲皮素、山柰酚、二氢槲皮素、二氢山柰酚和芦丁对照品，置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。经含量折算后，得各对照品的质量浓度分别为1.40、1.04、1.30、5.00、2.50、2.20、3.20 mg·mL－1。对照品总离子流和提取离子色谱图见图1。

图1 混合对照品总离子流和提取离子色谱图Fig 1 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of mixture reference

2.2.2 供试品溶液 取红豆杉粉末（批号：YP20 200328，粉碎后过4 号筛），精密称取细粉1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇40 mL，称量，超声（400 W，40 kHz）提取20 min，静置至室温，再称量，用50%甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。东北红豆杉样品总离子流和提取离子色谱图见图2。

图2 东北红豆杉样品总离子流和提取离子色谱图Fig 2 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.sample

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取混合对照品储备溶液适量，用50%甲醇稀释得系列浓度的混合对照品溶液（银杏双黄酮：0.140 ～14.0 μg·mL－1；金松双黄酮：0.208 ～20.8 μg·mL－1； 槲皮素：0.001 30 ～0.130 μg·mL－1；山柰酚：0.005 00 ～0.500 μg·mL－1； 二氢槲皮素：0.002 50 ～0.250 μg·mL－1；二氢山柰酚：0.0220 ～2.20 μg·mL－1； 芦丁：0.320 ～ 32.0 μg·mL－1），进样测定，以质量浓度C（μg·mL－1）为横坐标，峰面积A为纵坐标，计算7 种成分的线性回归方程，结果见表3，7 种成分在各自线性范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表3 线性关系结果(n ＝7)Tab 3 Linear regression of the 7 compounds (n ＝7)

2.3.2 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样6 次，记录各成分峰面积并计算相对标准偏差（RSD）。结果银杏双黄酮、金松双黄酮、槲皮素、山柰酚、二氢槲皮素、二氢山柰酚和芦丁峰面积的RSD分别为0.76%、0.86%、0.72%、0.89%、0.84%、0.73%和0.76%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批样品（批号：YP20200328）6 份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录各成分峰面积并计算RSD。结果银杏双黄酮、金松双黄酮、槲皮素、山柰酚、二氢槲皮素、二氢山柰酚和芦丁峰面积的RSD分别为1.1%、1.7%、1.0%、1.8%、1.3%、1.9%和1.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批样品供试品溶液（批号：YP20200328），分别于0、2、4、8 和12 h 进样分析，记录各成分峰面积并计算RSD。结果银杏双黄酮、金松双黄酮、槲皮素、山柰酚、二氢槲皮素、二氢山柰酚和芦丁峰面积的RSD分别为2.1%、2.1%、1.3%、1.4%、1.6%、1.5%和1.7%，表明供试品溶液12 h 内稳定性良好。

2.3.5 加样回收试验 取已知含量的样品（批号：YP20200328）6 份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入适量对照品溶液后，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，进样分析，计算加样回收率，结果银杏双黄酮、金松双黄酮、槲皮素、山柰酚、二氢槲皮素、二氢山柰酚和芦丁的平均回收率为98.9%、100.7%、99.0%、99.3%、98.8%、101.7%和100.1%，RSD分 别 为1.0%、2.4%、1.7%、1.8%、1.7%、1.1%和2.3%，表明本方法回收率良好。

2.4 样品测定

精密称取8 批次不同批号的东北红豆杉各两份，分别按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下条件进样测定，计算7种成分含量，结果见表4。

表4 8 批次样品中7 种黄酮的含量(μg·g－1，n ＝2)Tab 4 Contents of the 7 flavones in 8 batches of samples (μg·g－1，n ＝2)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备条件优化

本研究考察了不同的提取溶剂（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇），提取体积（30、40、50 mL），提取时间（10、20、30 min），以7 种黄酮的峰面积大小为判断依据，确定当用40 mL 50%甲醇提取20 min 时，7 种黄酮的峰面积均达到最大值。

3.2 色谱条件优化

3.2.1 色谱柱的选择 比较了两种色谱柱，Welch Xtimate C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和Thermo Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），以7种黄酮的分子离子峰的保留性和峰形等因素为判断依据，结果两款色谱柱均获得了较为合适的保留时间和较好的峰形。但使用Thermo Acclaim 120 C18柱时，二氢槲皮素和二氢山柰酚稍有前延峰。因此，选择Welch Xtimate C18色谱柱。

3.2.2 流动相的选择 比较了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含10 mmol·L－1乙酸铵的0.1%甲酸水溶液3 种流动相系统。结果，当选择乙腈-0.1%甲酸水溶液时，二氢槲皮素出现前延峰；当选择乙腈-水和乙腈-含10 mmol·L－1乙酸铵的0.1%甲酸水溶液时，峰形均对称，且各峰均完全分离。进一步对3 种不同流动相系统下的7 种黄酮成分的峰面积进行比较，发现当选择乙腈-水时各成分峰面积均最大。

3.3 总结

本研究建立了东北红豆杉中银杏双黄酮、金松双黄酮、槲皮素、山柰酚、二氢槲皮素、二氢山柰酚、芦丁7 种黄酮类成分的UHPLC-MS/MS含量测定方法，其中山柰酚、二氢槲皮素、二氢山柰酚和芦丁的含量测定方法在东北红豆杉中均为首次建立。本法为基于黄酮类成分对东北红豆杉进行质量评价提供了技术支持。