临时用重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂的配制和稳定性考察

阮丽梅，倪晓燕，吕凤文，陆静金，戴根苗，程钢*（.安徽医科大学第一附属医院药剂科，国家中医药管理局中药化学三级实验室，合肥 300；.安徽安科生物工程（集团）股份有限公司，合肥 30088）

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），简称“新冠肺炎”[1]，传播迅速，潜伏时间长，主要传播途径为呼吸道飞沫传播及密切接触传播[2-3]。为了减少新型冠状病毒（SARSCoV-2）的传播，应加强直接接触患者一线医务人员的防护，在采用物理防控措施的基础上，使用其他防护措施也是必要的。根据国家卫生健康委《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（试行第7 版）推荐，目前用于COVID-19 的抗病毒治疗主要有α-干扰素（α-IFN）、洛匹那韦、利托那韦（LPVr）及利巴韦林等[4]。其中重组人干扰素α-2b（rhIFNα-2b，以下简称IFNα-2b）具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。有研究表明α-干扰素的抗病毒机制可以预防病毒感染，持续用药，可能会起到类似疫苗的作用，而使用干扰素喷雾剂可阻断呼吸道病毒的快速传播，起到预防作用[5-6]。国外研究报告了SARS-CoV-2 对重组人干扰素α和β（IFNα/β）的敏感性，证明了IFNα/β在抑制SARS-CoV-2 感染方面的潜在功效[7]，并推荐使用低剂量的IFNα-2b 在鼻腔喷雾（每日2次，每次0.5×106IU），配合羟氯喹口服（每日50 ～100 mg），用于临床一线医务人员，以预防COVID-19[8]。目前国内已上市的IFNα-2b 喷雾剂没有鼻腔喷雾剂型，一般为皮肤科外用喷雾剂，适用于由病毒引起的初发或复发性皮肤单纯疱疹，并不能直接喷于鼻咽部[9-10]。基于此，我们考虑配制IFNα-2b 鼻腔喷雾剂为医护人员提供药物预防，本研究以α-干扰素雾化方案为基础，参考国内外多项鼻腔喷雾剂的相关文献[8，11-13]，确定了制剂的处方和用法，利用临床常用的IFNα-2b 注射液和0.9%氯化钠注射液配制临时用喷雾溶液，灌封于鼻腔用喷雾装置中，并考察喷雾剂的稳定性，旨在为临床一线医护人员预防COVID-19 提供安全保障。

1 试药与仪器

1.1 试药

IFNα-2b 注射液[安徽安科生物工程（集团）股份有限公司，规格：每支3.0×106IU，批号：20191230、20200206-1、20200206-2]，0.9%氯化钠注射液（中国大冢制药有限公司，规格：100 mL，批号：19110722），人羊膜成纤维细胞（WISH）、水疱性口炎病毒（VSV）株[安徽安科生物工程（集团）股份有限公司]，硫乙醇酸盐流体培养基（FTM，批号：20191021，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司），胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号：20191030，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）。

1.2 仪器

生物安全柜（SW-CJ-1F 型，苏州净化设备有限公司），隔水式培养箱（GHP9080，上海一恒科学仪器有限公司），恒温培养箱（FYL-YS-50LK，北京福意联电器有限公司），CO2培养箱（HERAcell vios 160i，Thermo Scientific），倒置显微镜（XDS-1B，重庆光电仪器有限公司），pH计（FE20，MettlerToledo），光吸收读板机（SpectraMax 190，Molecular Devices），多剂量鼻腔喷雾泵[规格：每喷100 μL，万通（苏州）定量阀系统有限公司]，无菌喷雾剂玻璃瓶[规格：10 mL，万通（苏州）定量阀系统有限公司]。

2 方法

2.1 鼻腔喷雾剂的制备

无菌条件下操作，取IFNα-2b 注射液（3.0×106IU∶1 mL）3 支，以一次性无菌注射器吸取并注入无菌喷雾剂玻璃瓶中，再加入0.9%氯化钠注射液6 mL，装入鼻腔喷雾泵，拧紧密封，并盖上防污罩，在瓶身贴上标签，共制作3 批，批号标注为A、B、C，分别对应IFNα-2b 注射液批号20191230、20200206-1、20200206-2。

2.2 稳定性考察

2.2.1 储存温度试验 将批号为A、B、C 的3 批样品分别于（5±3）℃（以下简称5℃）、（25±2）℃（以下简称25℃）、（37±2）℃（以下简称37℃），相对湿度（60±10）%条件下避光贮存，分别于0 d、7 d、14 d、1个月、2个月、3个月，按考察项目取样检测。

2.2.2 振摇试验 将3 批样品于5℃条件下避光贮存，置于摇床上振摇，振动幅度为±10°，振动频率为80 r·min－1。分别于0、7、14 d 按考察项目取样检测。

2.2.3 冻融试验 将3 批样品于（－20±5）℃放置48 h 完全冷冻，再置于5℃放置48 h 完全解冻，为一个冻融循环，分别于2 次、4 次冻融后按考察项目取样检测。

2.2.4 模拟使用试验 将3 批样品各取适量，模拟正常使用，每日4次，每次3喷，连续使用5 d，使用完毕后放置于5 ℃保存。分别于开始使用后的第1日、5日、1 个月、2 个月各取11 支样品，按考察项目取样检测。

2.3 考察项目

依据《中国药典》2015年版三部分别进行外观、pH 值、无菌、生物学活性检测。

2.3.1 外观性状 手持样品容器颈部于遮光板边缘处，轻轻旋转和翻转容器，以明视距离（通常为 25 cm）分别于黑色和白色背景下用目检视。质量标准：应为澄明液体，无肉眼可见异物。

2.3.2 pH 值 根据《中国药典》2015年版第四部通则 0631 进行检测。质量标准：pH 应为6.5 ～7.5。

2.3.3 无菌 根据《中国药典》2015年版第四部1101 无菌检查法，采用薄膜过滤法处理样品。质量标准：应无菌生长。

2.3.4 生物学活性 根据《中国药典》2015年版第三部第一法细胞病变抑制法（CPE），以中国食品药品检定研究院颁发的干扰素标准品校正。根据干扰素可以保护人羊膜细胞免受水泡性口炎病毒破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH 细胞染色，于波长570 nm 处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH 细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。质量标准：应为标示量的80%～150%，标示量为每瓶900 万IU/9 mL。

3 结果

3.1 不同储存温度考察结果

A、B、C 3 批样品0 个月的生物学活性分别为标示量的111%、111%和108%，于5℃、25℃存放3 个月、于37 ℃存放1 个月，3 批样品生物学活性（%）在108%～137%，其他各项指标检测结果也均符合质量标准要求，表明本品在5℃、25℃条件下可存放3 个月、于37℃条件下可存放1 个月，见表1。

表1 3 批IFNα-2b 鼻腔喷雾剂在不同温度下储存不同时间的稳定性Tab 1 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray stored at different temperatures and time

3.2 振摇试验考察结果

3 批样品振摇试验14 d，期间检测各项指标，生物学活性（%）在102%～126%，其他各项检测结果均符合质量标准要求，表明振摇条件下本品至少能保存2 周，见表2。

表2 3 批IFNα-2b 鼻腔喷雾剂在振摇条件下的稳定性Tab 2 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray under vibration conditions

3.3 冻融试验考察结果

3 批样品在第2、4 次冻融循环后检测各项指标，生物学活性（%）在100%～137%，其他各项检测结果均符合质量标准要求，表明冻融4 次后本品稳定性良好，见表3。

表3 3 批IFNα-2b 鼻腔喷雾剂冻融4 次的稳定性Tab 3 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray freeze-thaw 4 times

3.4 药品模拟使用后5℃储存稳定性

3 批样品模拟使用5 d 后、5 ℃存放2 个月，结果生物学活性在99%～115%，其他各项检测结果均符合质量标准要求，表明模拟使用后本品仍能保存2 个月，见表4。

表4 3 批IFNα-2b 鼻腔喷雾剂模拟使用后5 ℃储存的稳定性Tab 4 Stability of 3 batches of IFNα-2b nasal spray stored at 5 ℃after the simulated test

4 讨论

4.1 研究目的和意义

在疫情期间，国家卫生健康委发布了系列方案、指南、通知等，根据医务人员接触COVID-19患者可能性及其暴露风险，提出分级防护措施[14]。但防护重点侧重于物理隔离，比如戴口罩，穿隔离衣，戴护目镜等，药物预防则主要集中于中药汤剂[15]，西药预防未特别强调。α-2 型干扰素作为广谱抗病毒药，是《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》1 ～7 版推荐的主要治疗药物之一，推荐用法是大剂量雾化吸入（5.0×106IU/次，每日2 次），吸入的药物颗粒沉积于气道和肺部发挥疗效。关于α-2型干扰素作为鼻腔预防用药，在鼻腔发挥疗效，则鲜有推荐报道，究其原因，是因为美国20 世纪80年代临床试验证实α-2 型干扰素对鼻黏膜有刺激作用（干黏膜、结痂、血涕等）[16-18]，从而限制了喷雾剂作为呼吸道病毒感染预防用药的使用，至今美国FDA 未批准该剂型上市，中国亦然。而近期较多的研究表明，小剂量应用IFNα-2b 鼻腔喷雾，可有效防治各类病毒性上呼吸道疾病，包括预防COVID-19[8，19]，且不良反应并不明显。医院药学人员因地制宜，于静配中心生物安全柜内无菌操作，用IFNα-2b 注射液和0.9%氯化钠注射液配制临时用鼻腔喷雾剂，在保证关键质量的前提下，可迅速供给一线医务人员使用。

4.2 喷雾剂处方与用法的思考

国内对IFNα-2b 鼻腔喷雾剂的剂量和安全性相关研究集中于2003年SARS 疫情之后，在参考国外报道的基础上，陈清团队[11-13]进行了大样本（＞4000 人）的随机对照试验，成人日剂量1.8×106IU，每日用药2 次，每次两侧鼻腔、咽喉各一喷，连续使用5 d，结果不良反应轻微，且均为可逆性反应，未出现血涕和严重不良反应报告，这可能与使用剂量低、用药时间短有关[12]。本次COVID-19 疫情发生之后，有国外研究再次推荐使用低剂量IFNα-2b 鼻腔喷雾预防COVID-19[8]，日剂量1.0×106IU，每日鼻内喷雾2 次，既可减轻由SARS-CoV-2 引起的感冒症状，又可最大程度地降低IFNα-2b 的不良反应。

本试验在参照国内外研究的基础上，将喷雾剂的处方定为：IFNα-2b 注射剂3 支（3.0×106IU/支）与0.9%氯化钠注射液6 mL 混合配制而成，相当于喷雾剂中IFNα-2b 的含量为1.0×106IU·mL－l；用0.9%氯化钠作溶剂是为了维持渗透压，保持等渗状态[20]。推荐用法为：每日2 ～3 次，每次两侧鼻腔各1 喷、咽喉2 喷，以每喷量100 μL 计，相当于日剂量0.8×106～1.2×106IU，与文献预防推荐量（日剂量1.0×106IU）接近[8]；使用时间为5 d，达到预防效果的同时避免严重不良反应。适用人群为临床一线健康和有轻度呼吸道病毒感染症状的医务人员。从本院医务人员的使用情况反馈来看，用药耐受性良好，未发生严重不良反应，用药人员均未发生呼吸道病毒感染（包括COVID-19）。

4.3 稳定性考察结果分析

由于IFNα-2b 注射剂处方中含有人血白蛋白，为生物制剂，对各种环境条件的改变较敏感，本试验考察了样品在不同温度下储存的稳定性，在5℃条件下稳定性良好，至少可保存3 个月；在25℃和37℃条件下也可以保存一段时间，提示在临床使用中即使忘记放入冰箱冷藏，短时间内也依旧安全有效；通过冻融试验和振摇试验表明样品在极端环境下储存和颠簸的运输过程中依然可以保持良好的稳定性；模拟使用5 d 后的稳定性考察表明，用药结束后于5℃放置2 个月，各项检测指标均未发生较大变化，说明喷雾装置的密闭性良好，能充分防止微生物和细菌的进入，在必要时可继续使用。

4.4 制剂的优点与展望

鼻喷雾剂的处方通常包括原药、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂及缓冲剂等辅料，但是有的药用辅料有一定的毒性，可能会对制剂安全性产生影响[21-22]，而本试验配制的鼻喷雾剂直接用0.9%氯化钠注射液稀释而成，未添加其他辅料，可以避免辅料的毒副作用；国内上市的2 种IFNα喷雾剂商品名为捷抚（IFNα-2b，10 mL∶1.0×106IU，120 喷/瓶）和运德素（IFNα-1b，5 mL∶0.25×106IU），规格剂量小，即使可以临时替代使用，但要达到1.0×106IU 的日剂量，需要喷120 喷（用完整瓶）或以上，临床不易接受。而本次试验配制的规格（9 mL∶9.0×106IU）每日只需喷8 ～12 喷，一瓶能保证5 ～7 d用量，使用方便。试验采用的无菌喷雾装置易于在市场上购得，利用医院静脉配置中心的无菌条件即可完成配制，不需要其他特殊设备，操作简单，现配现用，特别适合新冠疫情等临时性突发公共事件下对药物特殊剂型的需求。

有研究表明，在治疗COVID-19 时，干扰素雾化吸入可以产生气溶胶污染空气，增加医护人员和患者交叉感染的风险[23-24]，而本试验配制的喷雾剂与雾化吸入相比，不受使用环境及雾化设备的限制，患者依从性好，不易产生气溶胶污染环境。但其能否在轻症COVID-19 患者的治疗中代替雾化吸入治疗，从而减少交叉感染，需要继续深入研究。当然，IFNα-2b 鼻喷雾剂在预防中还缺乏相关的临床研究，其有效性和安全性还需要进一步验证。