马里苷通过调控自噬保护糖尿病db/db小鼠心肌损伤

祖力皮亚·阿布拉，李甜，兰怡，克迪热亚·卡迪尔，宋志鹏，张博翔，张雁潮，彭小雨，毛新民，5*（.新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 80000；.新疆医科大学基础学院，乌鲁木齐 80000；.新疆医科大学附属中医医院，乌鲁木齐 80000；.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 80000；5.新疆维吾尔自治区中西医重点学科，乌鲁木齐 80000）

糖尿病是以细胞因子介导炎症反应诱导胰岛β细胞功能障碍，引起胰岛素抵抗或进行性分泌不足的以血糖、血脂、蛋白质代谢紊乱为特征的代谢性疾病[1]。其中2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）在糖尿病类型中最为常见，主要表现特征有高血糖、胰岛素分泌缺陷、胰岛素抵抗和高胰岛素血症等。心血管病变的加速发展是2 型糖尿病主要致死致残的主要原因之一[2]。寻找新的靶点或药物对糖尿病患者的心肌病变进行预防和治疗具有重要临床意义。

目前，糖尿病心肌病变的机制不清。自噬是真核生物细胞内普遍存在的一种自稳机制，它通过溶酶体降解来消除细胞中多余和受损的结构，以维持细胞正常生理功能，从而适应各种不良刺激[3]。自噬在维持心脏功能和形态中起着重要作用。心肌细胞自噬不仅是心肌细胞正常的生理反应，同时还参与心脏功能紊乱、心肌纤维化、心肌肥大等心肌损伤过程，调控心肌细胞自噬对心肌功能紊乱发挥积极作用[4]。

两色金鸡菊（Coreopsis tinctoriaNutt）又名昆仑雪菊，为菊科金鸡菊属的野生草本植物，始载于《新华本草纲要》[5]，其头状花序入药，具有降血糖、降血脂、降压、软化血管、抑制细菌生长的功效，是防治糖尿病、冠心病等疾病的特殊药食两用的草药[6]。研究发现，两色金鸡菊富含黄酮类化合物[7]。马里苷（marein）是黄酮类化合物的主要活性成分之一，为查尔酮主要的葡萄糖苷[8]，其具有良好的降血糖[9]、调血脂、降血压[10]等功效。本课题组前期研究已证实，两色金鸡菊的活性成分通过降血糖、抗氧化应激等发挥保护肾脏、肝脏的作用，但对心脏保护作用的机制仍有待于研究。因此，本实验研究两色金鸡菊中马里苷对2 型糖尿病db/db 小鼠心肌细胞损伤的保护作用及作用机制。

1 材料

1.1 动物

5 ～6 周龄，SPF 级雄性db/db 小鼠24 只，雄性db/m 小鼠6 只，体质量22 ～35 g [江苏卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2016-0010]。本实验所用db/db和db/m 小鼠及实验饲养条件均符合国家科学技术委员会制订的《实验动物管理条例》。

1.2 试药

马里苷由本课题组提取（新疆医科大学药学院从两色金菊中提取，HPLC 法测定纯度为99%），盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，批号：H20023370），小鼠胰岛素（INS）ELISA 试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司，批号：MB-3315B 48T），苏木素（Biosharp life Science，批号：69090030），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Thermo，批号：RH237562），聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）凝胶试剂盒（北京索莱宝有限公司，批号：20190708），抗LC3Ⅱ/Ⅰ单克隆抗体（批号：4108S）、抗P62 单克隆抗体（批号：39749S）（美国 Cell-Technology 公司），GAPDH（批号：GA003-R）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H ＋L）二抗（批号：IH-0011）（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。

1.3 仪器

卓越精采血糖仪（瑞士Roche 公司），STS-2型脱色摇床（上海琪特分析仪器有限公司），Axio-ObserverZ1 倒置显微镜（德国ZEISS），Benchmark PLUS 全波长酶标仪、156-8001 型垂直电泳槽、Gel-DocXR ＋凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 分组与给药

db/db 小鼠24 只，按体质量和空腹血糖值（FBG）随机分为模型组、阳性对照组（盐酸二甲双胍 280 mg·kg－1）和实验组（马里苷，50 mg·kg－1）[11-12]，每组6 只；选取同来源的db/m小鼠6 只设为正常对照组。各组灌胃给药，每日1 次，连续8 周，模型组和正常对照组给予相应的等体积的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液。

2.2 小鼠体质量和FBG 检测

观察各组小鼠的精神状态、活动情况，记录大鼠摄食、饮水情况，注意小鼠皮毛色泽的变化等；给药后每周检测小鼠体质量；在给药干预的第0、4、6、8 周，小鼠禁食不禁水，尾静脉采血，用血糖仪检测各组小鼠FBG。

2.3 生化检测TC 和TG 含量

各组小鼠用药物干预8 周后，禁食12 h 不禁水，眼眶取血，37℃放置30 min，3000 r·min－1离心10 min，分离血清。采用生化仪检测血清中TC、TG 含量。

2.4 ELISA 检测血清胰岛素含量

采用ELISA 法按试剂盒说明测定血清胰岛素水平。

2.5 HE 染色观察小鼠心肌组织病理形态改变

小鼠颈脉脱臼处死，迅速提取小鼠心脏，用遇冷的生理盐水冲洗干净，吸水纸吸干多余的水分，即得心肌组织。取心肌组织，用4% 多聚甲醛溶液固定24 h 后，脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色，脱水透明，封固，在光镜下观察小鼠心肌组织形态学改变。

2.6 透视电镜观察自噬小体

剪取约1 mm2小块左心室组织置于2.5% 戊二醛固定，用 PBS 清洗，用四氧化锇固定液固定2 h 后弃固定液，用乙醇逐级脱水，包埋切片，使用透视电镜观察心肌细胞自噬体。

2.7 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测分析

将冷存的心肌组织解冻，取50 mg 组织研磨，加入预冷的含1% 蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液500µL，裂解30 min，匀浆，离心10 min（4℃ 12 000 r·min－1），取上清液，并用BCA 蛋白试剂盒测定蛋白浓度；通过电泳，转膜，封闭，抗体孵育，显色成像。以GAPDH 为内参，检测微管关联蛋白1A 和1B（LC3）、SQSTM1 蛋白（p62）的表达。

2.8 统计学分析

数据采用SPSS 21.0 统计软件进行分析处理，结果采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），当P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 马里苷对db/db 小鼠FBG 和体质量的影响

正常对照组小鼠FBG 和体质量稳定。与正常对照组比较，模型组小鼠FBG 和体质量明显升高；与模型组相比较，实验组FBG 和体质量无明显变化（见图1）。

图1 马里苷对空腹血糖、体质量的影响Fig 1 Effect of marein on fasting glucose and body mass

3.2 马里苷对小鼠TC、TG 及胰岛素水平的影响

正常对照组小鼠TC、TG 及胰岛素水平稳定。模型组小鼠较正常对照组小鼠血清中TC、TG 及胰岛素水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，实验组TC、TG 及胰岛素水平显著降低（P＜0.01），说明马里苷可改善db/db 小鼠血脂异常和胰岛素抵抗（见表1）。

表1 马里苷对TC、TG 及胰岛素水平的影响(± s)Tab 1 Effect of marein on the level of TC，TG and insulin (± s)

表1 马里苷对TC、TG 及胰岛素水平的影响(± s)Tab 1 Effect of marein on the level of TC，TG and insulin (± s)

注（Note）：与正常对照组比较，##P ＜0.01；与模型组比较，**P ＜0.01（Compared with the normal control group，##P ＜0.01；compared with the model group，**P ＜0.01）。

胰岛素/（mU·L－1）正常对照组 1.82±0.521.43±0.1530.11±1.71模型组10.19±1.52##7.70±1.36##36.70±0.85##阳性对照组 7.62±1.25**5.86±0.59**25.93±3.99**实验组 6.10±1.31**4.74±1.47**29.21±3.29**组别TC/（mmol·L－1）TG/（mmol·L－1）

3.3 小鼠心肌组织形态学变化

心肌组织HE 染色结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠心肌纤维肥大、肿胀明显、可见部分心肌纤维断裂及局部炎细胞浸润、细胞间质明显增多。阳性对照组和实验组小鼠心肌纤维无明显肥大、肿胀、心肌间质正常（见图2）。

图2 马里苷对db/db 小鼠心肌组织病理学的影响（HE，400×）Fig 2 Effect of marein on the myocardial histopathology in db/db mice（HE，400×）

3.4 透射电镜观察心肌组织超微结构和自噬小体

透射电镜检测显示，正常对照组小鼠显示连续规则的肌节并构成肌原纤维，线粒体分布于肌原纤维之间，自噬小体形成；而模型组小鼠出现肌原纤维断裂、肌原原纤维紊乱、线粒体排列紊乱，自噬小体数量减少；马里苷干预后上述情况有所改善，且自噬小体数量有所增加（见图3）。

图3 马里苷对心肌超微结构和自噬小体的影响Fig 3 Effect of marein on the myocardial ultrastructure and autophagosomes

3.5 马里苷对心肌组织自噬指标p62 和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达的影响

自噬对心脏功能及结构的维持至关重要，在应激状态下自噬的激活可以通过降解、循环代谢产物产生能量来维持心肌细胞存活。Western blot 结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠心肌组织p62 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），LC3-Ⅱ/Ⅰ表达水平显著降低（P＜0.01），表明心肌细胞自噬被抑制；马里苷干预后，小鼠心肌组织p62表达水平显著降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ/Ⅰ表达水平显著升高（P＜0.05），表明马里苷可以促进心肌细胞自噬（见图4）。

图4 马里苷对db/db 小鼠心肌自噬的影响Fig 4 Effect of marein on the myocardial autophagy in db/db mice

4 讨论

据流行病学调查统计，2019年全球糖尿病患病率为9.3%（4.63 亿人），到2030年预测患病率将上升到10.2%（5.78 亿），到2045年将上升到10.9%（7 亿）[13]。在2 型糖尿病患者中，患有心血管疾病的数量逐日上升[14]。1972年临床首次发现与2 型糖尿病有关的心肌病患者，并推测患者心肌病变由弥漫性心肌纤维化、心肌肥大和糖尿病性微血管引起的[15]。

马里苷为两色金鸡菊黄酮类化合物主要有效成分之一。马里苷具有抗氧化[16]和较好的自由基清除能力[17]，且可以改善高血糖引起的胰岛素抵抗，抑制细胞凋亡[12]。本研究发现，马里苷药物干预后，糖尿病小鼠TC、TG 和胰岛素水平显著降低。课题组前期研究发现，两色金鸡菊黄酮有效成分，在高糖诱导的HUVEC 细胞损伤模型中，通过促进自噬，从而发挥对HUVEC 内皮细胞损伤的保护作用[18]。本实验采用db/db 糖尿病动物模型，探讨两色金鸡菊黄酮主要有效成分马里苷通过调控自噬对糖尿病db/db 小鼠心肌细胞损伤的保护作用。

自噬是一种自我降解的过程，在平衡机体发育所需能量和调节营养等方面至关重要。自噬可以清除错误折叠或聚集的蛋白、受损的细胞器（包括线粒体、内质网、过氧化物酶体等）以及细胞内病原体，被认为是自我保护过程。自噬在癌症、糖尿病、神经变性、心肌病、肝病、感染性疾病与自身免疫性疾病等疾病的预防和治疗过程中发挥关键的作用[19]。Sybers 等[20]在1976年发现了心肌细胞内存在自噬现象，心肌细胞自噬失调导致心肌功能紊乱、心肌纤维化、心肌肥大、心力衰竭和过早死亡等[4]。自噬是维持心肌细胞大小以及整体心脏结构和功能的一种稳态机制，在衰竭心脏中通过上调自噬从而使心肌细胞免受血流动力学应激的影响[21]。自噬障碍可以引起心肌肥大、压力超负荷心力衰竭、缺血性心肌病及糖尿病心肌病等[22]。自噬的调控机制很复杂，它是由多种信号通路及其调控因子共同介导完成的。微管关联蛋白1A 和1B（microtubuleassociated proteins 1A/1B light chain 3，LC3）是一种可溶性蛋白，分布在哺乳动物组织中，是哺乳动物Atg8基因的同源物，主要定位在前自噬泡和自噬泡膜的表面，是自噬体特异性标志蛋白[23]。LC3 前体加工形成LC3-Ⅰ，经泛素化修饰后通过Atg7/Atg3 与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）结合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ转变到LC3-Ⅱ是自噬启动的标志，由LC3-Ⅱ/Ⅰ反映自噬表达水平[24-25]。p62 是一种多域蛋白，也是哺乳动物选择性自噬的载体蛋白[26]，p62 可与定位在自噬小体内膜上的LC3-Ⅱ形成复合体，从而削弱LC3-Ⅱ的活性，同时，p62 蛋白本身又受自噬调节的作用，其表达与自噬活性成负相关[27]。研究发现，高糖缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞中，自噬相关蛋白LC3 表达下调，p62 表达上调，高糖缺氧条件下，自噬功能受损，上调自噬可以降低凋亡率，保护细胞受损[28]。本实验研究发现，模型组中，LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达显著降低，p62 的表达显著升高，自噬小体数量减少，自噬被抑制，心肌肌原纤维断裂，心肌纤维肥大、肿胀、排列紊乱，心肌结构发生病理性改变；马里苷干预后，LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达显著升高，p62 的表达显著降低，自噬小体数量增加。提示马里苷可促进自噬，改善心肌组织结构，保护心肌细胞损伤。

综上所述，本实验首次探讨马里苷对糖尿病db/db 小鼠心肌细胞的保护作用，并初步证实马里苷通过促进自噬，改善心肌组织结构，保护心肌细胞损伤，但其具体机制有待进一步研究。