阿胶对去卵巢小鼠学习记忆及海马Aβ影响的研究

2021-09-04张晓双白黎明白璐陕西中医药大学陕西咸阳7046西安市第一医院药学部西安7000

中南药学 2021年8期

张晓双，白黎明，白璐（.陕西中医药大学，陕西咸阳 7046；.西安市第一医院药学部，西安 7000）

阿胶是马科动物驴及其他驴皮经煎煮浓缩制成的固体胶[1]，其性甘，平，归肺、肝、肾经，阿胶的药理作用广泛，有抗氧化、抗疲劳、提高免疫力、促进造血、抑制癌细胞、止血等作用。两千多年来，阿胶在中国作为一种保健食品和传统中药被广泛地应用于养生和临床治疗，常治疗妇科疾病如阴道出血、痛经、崩漏、不孕、月经先期、复发性流产、多囊卵巢综合征、宫颈癌等[2]。本课题组前期研究发现阿胶16 g·kg－1能提高正常小鼠的子宫系数，提高小鼠血清雌二醇（E2）含量，降低小鼠血清促黄体生成素（LH）和促卵泡素（FSH）的含量，使小鼠子宫内膜增厚，子宫腔增大，腺体数目增多，表明阿胶对正常小鼠具有一定的雌激素样作用[3]。流行病学数据显示，女性绝经后阿尔茨海默病（AD）的发病率是同龄男性的1.5 ～3 倍[4-5]，并且随着绝经后雌激素的减少，AD 的发生率增加。临床上雌激素替代疗法能显著改善绝经期妇女AD 的相关症状[6]，但会给患者增加患肿瘤的风险，从天然药物中寻找有效的AD 防治药物是目前研究的热点。本实验在前期研究基础上，考察阿胶对去卵巢小鼠学习记忆的影响。

1 材料

1.1 试药

阿胶（兰州佛慈制药股份有限公司，批号：19A55）；戊酸雌二醇片（补佳乐，批号：283A，法国拜耳公司）；Mouse ELISA E2kit（96t，森贝伽生物科技有限公司，批号：20191225）；HE 染色试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20190810）；免疫组化试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，批号：40113）；Aβ1-40 抗体（艾博抗贸易有限公司，批号：GR91656-18）。

1.2 动物

雌性未孕小鼠，体质量（20±2）g [成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2015-030]。

1.3 仪器

GB-204 电子天平（瑞士梅特勒）；Forma-86℃ULT Freezer（美国热电Forma）；KDC-160HR 高速冷冻离心机（安徽科大创新股份有限公司）；Morris 水迷宫视频分析系统（上海吉量软件科技有限公司）；德国Leica DM4000B LED 智能型生物显微镜（德国Leica）；BI-2000 医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模及分组及给药

选取健康雌性未孕小鼠，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液35 mg·kg－1麻醉。将小鼠腹位固定，在躯干下1/3，离开脊柱两侧各1 ～2 cm 处作纵形切口，长约 1 cm，用镊子拉出脂肪团，找到卵巢，结扎子宫角，剪去卵巢及余线。假手术组只切除卵巢附近的脂肪，不切除卵巢，将组织推回腹腔，缝合切口。腹腔注射青霉素，每日1 次，连续一周。逐只进行阴道涂片检查，每日1 次，选取连续5 d 为间情期小鼠供实验用。造模成功的小鼠按体质量随机分成模型对照组、阿胶高剂量组（16 g·kg－1）、阿胶中剂量组（8 g·kg－1）、阿胶低剂量组（4 g·kg－1）和阳性对照组戊酸雌二醇片（0.4 mg·kg－1）组，每组10 只，给药体积20 mL·kg－1，假手术组给予等体积生理盐水，连续灌胃30 d。

2.2 指标检测

2.2.1 Morris 水迷宫[4]在给药结束前5 d，开始进行4 d 的Morris 水迷宫的定向航行实验，记录从入水至找到安全平台的时间即逃避潜伏期，测试时间限定为90 s，超过者以90 s 计；空间探索实验行为测试第5日撤除平台，在站台的相邻象限将小鼠面向池壁放入水中，以原平台所在的Ⅱ象限作为目标区，记录90 s 时限内各组小鼠在原平台Ⅱ象限游泳时间与总游泳时间的比值和各组小鼠准确穿过原平台所在位置的次数。

2.2.2 ELISA 法测定血清E2的水平末次灌胃24 h 后，摘眼球取血，室温静置30 min 后3000 r·min－1离心15 min，分离血清，ELISA 法测定血清E2的水平。

2.2.3 HE 染色观察海马神经元的形态 Morris水迷宫测试结束后，各组小鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液0.1 mL/10 g 麻醉，快速开胸暴露心脏，将穿刺针通过左心室进入升主动脉，剪开右心耳，快速灌注 37 ℃生理盐水将血液冲干净后，缓慢灌注新鲜配制的4 ℃含4%多聚甲醛的 0.1 mol·L－1的磷酸缓冲液，断头剥离颅骨，在洁净冰盘上完整取出大脑，在4%多聚甲醛的磷酸缓冲液中固定，4 ℃保存，制备石蜡切片。HE 染色，观察海马神经元的细胞形态。

2.2.4 免疫组化法检测海马CA1 区Aβ的表达参照Aβ试剂盒说明书，按常规SABC 法进行，DAB 显色，苏木素复染。以细胞膜或细胞浆着色为棕黄色定为阳性细胞。

2.3 统计方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析。所有数据采用±s表示，组间比较采用t检验。

3 结果

3.1 阿胶对去卵巢小鼠Morris 水迷宫结果的影响

定向航行实验中，各组之间第1、2日的潜伏期未见明显差异。模型组小鼠第3、4日的潜伏期较假手术组明显延长（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组、阿胶高剂量组小鼠第3、4日的潜伏期明显缩短（P＜0.05）。空间探索实验，各组小鼠Ⅱ象限时间（%）差异无统计学意义。模型组站台穿越次数是0，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，阳性对照组，阿胶高、中剂量组站台穿越次数明显增加（P＜0.01）。结果见表1和图1。

表1 阿胶对去卵巢小鼠Morris 水迷宫定向航行实验和空间探索实验的影响(± s，n ＝10)Tab 1 Effect of Asini Corii Colla on Morris water maze directional navigation experiment and space exploration experiment in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

注（Note）：与假手术组比较，##P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01（Compared with the sham operation group，##P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

组别剂量逃避潜伏期/s空间探索实验第1日第2日第3日第4日Ⅱ象限时间/%站台穿越次数/次假手术组－76.46±22.5867.69±25.32 48.26±23.4835.69±18.5126.94±14.211.50±1.00模型组－77.84±20.1874.25±26.54 72.16±26.48## 67.59±26.35## 22.84±15.440.00±0.00##阳性对照组0.4 mg·kg－1 79.60±25.1864.51±22.28 57.42±28.14* 48.88±26.87*24.95±8.331.10±0.89**阿胶高剂量组16 g·kg－175.15±30.4665.62±33.85 59.45±38.72* 53.31±33.29*20.37±9.091.29±0.59**阿胶中剂量组8 g·kg－175.61±18.1271.18±22.73 66.11±30.0659.52±25.6524.56±9.511.43±0.64**阿胶低剂量组4 g·kg－180.82±19.3375.39±22.65 70.50±23.4464.52±25.2821.10±11.330.4±1.00

图1 阿胶对去卵巢小鼠Morris 水迷宫空间探索实验轨迹图Fig 1 Experimental trace of Asini Corii Colla on Morris water maze in ovariectomized mice

3.2 阿胶对去卵巢小鼠血清E2 激素水平的影响

与假手术组相比，模型组小鼠血清E2水平明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，阿胶高、中剂量组和阳性对照组小鼠血清E2水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表2。

表2 阿胶对去卵巢小鼠血清E2 激素水平的影响(± s，n ＝10)Tab 2 Effect of Asini Corii Colla on the serum E2 hormone level in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

组别剂量E2 /（ng·L－1）假手术组－52.20±10.57模型组－20.20±4.87##阳性对照组0.4 mg·kg－178.20±16.54**阿胶高剂量组16 g·kg－133.30±4.00**阿胶中剂量组8 g·kg－129.80±9.82*阿胶低剂量组4 g·kg－125.60±6.70

3.3 阿胶对去卵巢小鼠海马CA1 区组织形态学的影响

假手术组海马CA1 区可见紧密排列的锥体细胞，神经细胞核仁、核膜清晰，胞浆染色正常；模型组海马CA1 区锥体细胞排列紊乱，部分神经元脱失，神经元大小不一，形态改变，呈三角形或不规则形，核固缩，模糊不清，部分细胞皱缩呈细梭形；阳性对照组、阿胶高、中剂量与模型组相比，神经细胞核固缩减少，神经元变性程度减轻，完整锥体细胞数明显增多。结果见图2。

图2 阿胶对去卵巢小鼠海马组织形态学的影响（HE，200×）Fig 2 Effect of Asini Corii Colla on histomorphology of hippocampus in ovariectomized mice（HE，200×）

3.4 阿胶对去卵巢小鼠海马Aβ 的表达的影响

假手术组海马阳性细胞较少，染色较淡，模型组海马Aβ阳性细胞较多。与模型组比较，阳性对照组和阿胶高剂量海马Aβ阳性细胞减少，结果见图3。

图3 阿胶对去卵巢小鼠海马Aβ 表达的影响（免疫组化，200×）Fig 3 Effect of Asini Corii Colla on Aβ expression in hippocampus of ovariectomized mice（immunohistochemistry，200×）

3.5 图像分析结果显示

与假手术组比较，模型组海马Aβ阳性细胞积分光密度（IOD）显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，阳性对照组，阿胶高、中剂量组海马Aβ阳性细胞IOD 显著减少（P＜0.01，P＜0.05）。结果见表3。

表3 阿胶对去卵巢小鼠海马Aβ 阳性细胞积分光密度(± s，n ＝10)Tab 3 Effect of Asini Corii Colla on integral optical density of Aβ positive cells in the hippocampus of ovariectomized mice (± s，n ＝10)

注（Note）：与假手术组比较，##P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01（compared with the sham operation group，##P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

组别剂量 IOD假手术组－38.28±8.37模型组－75.50±10.23##阳性对照组0.4 mg·kg－155.18±9.18**阿胶高剂量组 16 g·kg－153.58±11.32**阿胶中剂量组 8 g·kg－162.38±12.65*阿胶低剂量组 4 g·kg－167.28±12.82

4 结论

雌激素是人体内重要的类固醇激素，雌激素主要包括E2，其次为雌酮和雌三醇，E2的生理功效最强，雌激素在体内含量的变化影响生殖系统、中枢神经系统、心血管系统、免疫系统、骨骼系统等的生理代谢过程[7]。卵巢是雌激素的主要来源，妇女进入绝经期后，体内雌激素水平将会快速下降，导致更年期综合征、骨质疏松症、AD 和心血管疾病等。更年期妇女采用雌激素替代疗法来治疗或预防这些绝经期易出现的症状。但长期应用雌激素易产生高血压、水肿等不良反应，并增加乳腺癌及子宫内膜癌等妇科肿瘤的发病危险。因此人们一直致力于寻求雌激素替代物，期望这种替代物既能发挥雌激素对心脑血管等系统的保护作用，缓解更年期综合征，又能避免上述不良反应，这类物质即被称为选择性雌激素受体调节剂[8]。

女性绝经后体内雌激素分泌减少会带来许多生理、心理上的变化[9]。流行病学数据显示，围经期女性存在较高的AD 患病率，而且随着绝经后雌激素的减少，AD 的发生率越高。雌激素对于AD 有积极的影响，雌激素能够促进脑内神经细胞轴突、树突的生长、突触的形成，雌激素可促进长时程增强而促进学习记忆，雌激素具有抗兴奋性氨基酸毒性、增加大脑皮质血流量和提高大脑葡萄糖的利用率，雌激素可减少神经细胞的凋亡并且可以防止毒性Aβ片段的产生等[10-11]。去卵巢所致动物模型和雌激素信号通路常用于AD的发病机制及抗AD 药物的药效与机制研究[12]。

阿胶属于胶类药材，为动物的皮熬制而成的明胶类物质。从阿胶中检测和分离出来的成分主要包括氨基酸、蛋白质/明胶、多糖、挥发性物质、无机物等。阿胶以滋阴补血、补虚止血为见长，适用于血虚萎黄，眩晕心悸、肌痿无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽，劳嗽咯血，便血崩漏，妊娠胎漏等病症[13]。本次实验结果表明，阿胶能够改善去卵巢AD 小鼠的学习记忆能力，高剂量组作用比较显著，可能与其神经元保护作用和减少Aβ沉积有关。其作用机制还待进一步研究。