甘草次酸抑制幽门螺杆菌诱导的Th17炎性反应研究

于卫华，郑倩婧，马翠（空军军医大学第一附属医院消化内镜中心，西安 710032）

幽门螺杆菌是一种常见的革兰氏阴性菌，具有很高的感染率[1]，其感染主要发生在胃部黏膜中，存活时间较长，且不易根除，是引发人类慢性胃炎的重要病因之一，其中Th17 细胞免疫反应等与幽门螺杆菌感染及病理反应的发生密切相关[2-3]。我国医药人员通过中医药方式治疗幽门螺杆菌诱发的慢性胃炎病症取得了显著效果[4-5]，然而由于中药制剂成分复杂，其作用机制并不清楚。

中药甘草对于幽门螺杆菌的抑制和清除效果已有报道，其主要成分甘草次酸是一种已知的三萜类化合物，具有抗炎、抗病毒等多种药理作用[6-7]。本研究拟以幽门螺杆菌感染的慢性胃炎小鼠模型及体外Th17 细胞模型为研究对象，分析甘草次酸对幽门螺杆菌诱发慢性胃炎的作用及机制，为甘草治疗慢性胃炎提供佐证。

1 材料

1.1 实验动物与细胞

SPF 级雄性C57Bl/6 小鼠，4 周龄，体质量19 ～21 g [合格证号：SYXK（陕）2020-004，空军军医大学实验动物中心]；RAW 264.7 巨噬细胞由本中心实验室保存；外周血单核细胞分离自正常小鼠。

1.2 试药

甘草次酸（纯度：98%，批号：G0149，Sigma公司）；ELISA 试剂盒（Invitrogen 公司）；WST-8试剂盒（碧云天生物技术研究所）；流式细胞仪（Becton-Dickinson 公司）；青霉素/链霉素（批号：15140148）、胎牛血清（FCS，批号：26400044）、RPMI 1640 培养基（批号：C11875500BT）（Gibco公司）；anti-CD28 抗体（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；anti-CD3 抗体（Abcam 公司）；重组鼠BAFF（rBAFF）（Enzo Life Sciences 公司）；BAFF 抗体（Adipogen 公司）。

2 方法

2.1 小鼠模型制备与处理

采用幽门螺杆菌感染法制备小鼠模型[8]。CagA＋/VacA＋幽门螺杆菌株接种于含5%FCS 的布鲁氏肉汤中，37℃振荡培养2 d。将0.5 mL 幽门螺杆菌悬液（1×108菌·mL－1）用钢导管接种于C57Bl/6 小鼠（6 周龄）胃部，继续喂养4 周，制备模型。

模型小鼠随机分为模型组和处理组，每组8只。处理组：小鼠每日尾静脉注射甘草次酸悬液（8.0 mg·kg－1），持续1 周；模型组：注射等量生理盐水；另设未处理的正常小鼠为对照组（8只）。各组末次给药后禁食24 h，断头处死，剖腹取胃，收集胃黏膜组织，使用PBS 缓冲液对胃黏膜组织进行冲洗后，按1 g 组织加9 mL PBS 匀浆液对组织匀浆，进行后续检测。

2.2 细胞培养与处理

RAW 264.7 巨噬细胞于37℃条件下培养于含10%FCS、100 U·mL－1青霉素/链霉素的DMEM培养基中。采用密度梯度离心法自正常小鼠外周血分离获得外周血单核细胞，然后通过磁性细胞分选试剂盒从其中分离纯化出CD4＋T 细胞（纯度达93%以上），培养于含10% FCS 和青霉素/链霉素（100 U·mL－1）的RPMI 1640 培养基中；将单核细胞于含IL-4（50 ng·mL－1）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（100 ng·mL－1）的培养基中培养6 d，每3日更换新鲜培养基，收集获得DC 细胞；将CD4＋T 细胞培养液中添加0.1 μg·mL－1anti-CD28、0.5 μg·mL－1anti-CD3 抗体，共培养3 d 后收集获得Th17 细胞。上述获得的Th17 细胞、巨噬细胞、DC 细胞、CD4＋T 细胞分别与幽门螺杆菌（MOI ＝0.5）于37℃共培养12 h，更换新鲜培养基，加入75 ng·mL－1甘草次酸（DMSO 溶解后使用培养液稀释至所需浓度）培养24 h，收集上清液进行后续分析。各细胞悬液中加入rBAFF（50 ng·mL－1）或BAFF 抗体（1 μg·mL－1）培养24 h，收集上清液进行检测，评价BAFF 功能。

2.3 ELISA 试剂盒法检测炎性因子

采用ELISA 试剂盒法分别检测各组小鼠胃黏膜组织或培养的细胞上清液中IL-6、TGF-β、IL-1β、IL-10、IL-17、BAFF 因子水平。

2.4 流式细胞术检测

CD4＋T 细胞处理24 h 后，调整细胞密度至1×106个·mL－1，加入FITC-IL-17 抗体染色，进行流式细胞分析。

2.5 统计分析

数据分析采用SPSS 22.0 软件，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较用t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 甘草次酸对幽门螺杆菌诱导的慢性胃炎小鼠炎性因子水平的影响

与对照组相比，模型小鼠胃黏膜组织中及幽门螺杆菌感染的巨噬细胞上清液中促Th17 炎性因子IL-6、TGF-β、IL-1β水平均显著升高，而抑炎因子IL-10 水平则明显降低（P＜0.01），见图1；与模型组相比，甘草次酸处理组中IL-6、TGF-β、IL-1β水平则明显下降，IL-10 水平显著上升（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 甘草次酸对幽门螺杆菌诱导的慢性胃炎中炎性因子的影响Fig 1 Effect of glycyrrhetinic acid on the inflammatory factor in H.pylori-induced chronic gastritis

3.2 甘草次酸对幽门螺杆菌诱导的慢性胃炎中Th17 细胞反应水平的影响

与对照组相比，模型小鼠胃黏膜组织及幽门螺杆菌感染的CD4＋T 细胞上清液中IL-17 水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，处理组中IL-17 水平则明显下降（P＜0.01），见图2；同时处理组CD4＋T 细胞中IL-17＋细胞占比也较模型组显著减少（P＜0.01）。

图2 甘草次酸对幽门螺杆菌诱导的慢性胃炎中Th17 细胞反应的影响Fig 2 Effect of glycyrrhetinic acid on Th17 in H.pylori-induced chronic gastritis

3.3 甘草次酸对幽门螺杆菌诱导的慢性胃炎中BAFF 因子表达的影响

与对照组相比，模型小鼠胃黏膜组织中及幽门螺杆菌感染的DC 细胞、CD4＋T 细胞上清液中BAFF 因子水平均显著升高；与模型组相比，处理组中BAFF 因子水平则明显下降（P＜0.01），见图3。

图3 甘草次酸对幽门螺杆菌诱导的慢性胃炎中BAFF 因子的影响Fig 3 Effect of glycyrrhetinic acid on BAFF in H.pylori-induced chronic gastritis

3.4 甘草次酸对BAFF 诱导的促Th17 因子的影响

在幽门螺杆菌感染的巨噬细胞和单核细胞中，重组rBAFF 处理可显著上调促Th17 因子IL-6、TGF-β、IL-1β水平，相反BAFF 单抗处理则会下调其水平（P＜0.05），见图4；甘草次酸对促Th17 因子的抑制作用可被rBAFF 削弱，被BAFF 单抗处理加强（P＜0.05）。

图4 甘草次酸对BAFF 诱导的促Th17 因子的影响Fig 4 Effect of glycyrrhetinic acid on pro-Th17 cytokines induced by BAFF

4 讨论

甘草次酸为中药材甘草的主要成分之一，属于三萜化合物的一种[9]。研究表明，甘草在传统中医药治疗慢性胃炎及其他消化系统类疾病中发挥着重要作用，其中甘草次酸等成分在幽门螺杆菌等胃肠道病原菌的抑制作用中扮演着关键角色[10-12]，然而，其在幽门螺杆菌诱发的慢性胃炎中的药理作用及调控机制鲜有报道。本实验从T细胞免疫反应的角度探讨了甘草次酸对幽门螺杆菌感染引发的炎性反应的作用机制。

T 细胞免疫反应有助于清除细菌引发的组织感染症状，其中Th1 型反应即与幽门螺杆菌相关疾病有关，这类细胞反应负责清除细菌，同时也会造成受感染组织发生损伤[13]。近年来研究发现，Th17 细胞免疫反应也与幽门螺杆菌感染有关[14]。Th17 是能分泌IL-17 炎性因子的辅助性T 细胞，由CD4＋T 细胞分化而来。然而Th17 细胞与Th1反应相反，其有利于细菌的生长，从而加速了幽门螺杆菌感染引起的病理反应[15-17]。本研究发现幽门螺杆菌感染后，CD4＋T 细胞向Th17 细胞分化频率增加，胃黏膜中IL-17 分泌量增加，而甘草次酸则能显著抑制Th17 细胞的活化和IL-17 的产生。

B 细胞活化因子BAFF 是来源于TNF 家族的关键细胞因子，多由单核细胞、树突状细胞分泌合成，在B 细胞的生存和发育中起着至关重要的作用[18]。BAFF 可由幽门螺杆菌诱导表达，Munari 等[19]研究发现BAFF 在幽门螺杆菌阳性患者胃黏膜中高度表达。既往证据表明，高表达的BAFF 也是Th17 细胞产生和分化的关键促进因子[20]。BAFF 能激活单核细胞、树突状细胞中TGF-β、IL-1β炎性因子的产生，而后者对于Th17细胞的诱导分化具有显著促进作用[21]。本研究发现，在幽门螺杆菌感染的小鼠和体外DC 细胞、CD4＋T 细胞上清液中BAFF 因子均呈高水平表达态势，而甘草次酸则能明显降低BAFF 水平，并可减少幽门螺杆菌感染的巨噬细胞和单核细胞中BAFF 诱导的促Th17 因子IL-6、TGF-β、IL-1β的产生，从而发挥抑制Th17 细胞反应的作用。

综上所述，本文以幽门螺杆菌感染的慢性胃炎小鼠模型及体外Th17 细胞模型为研究对象，证实了甘草次酸对幽门螺杆菌诱发慢性胃炎中Th17 细胞反应具有抑制作用，其机制可能与甘草次酸抑制BAFF 炎性因子的产生及减少促Th17因子的产生作用有关。该结果为中药甘草及甘草次酸用于慢性胃炎的治疗提供了实验依据。