快速褪黑色素方法在免疫组织化学染色中的应用

赖续文，王蔚，仝桂慧，朱铭谊 ，赖晃文，王卓才，张伟*

（南部战区总医院1病理科，2基础医学实验室，广州，510010）

在常规病理诊断中，恶性黑色素瘤的组织和细胞标本需要做免疫组织化学染色进行诊断与鉴别诊断，但这些组织和细胞标本由于黑色素颗粒的存在，而使细胞形态模糊、不易辨认，干扰免疫组织化学抗原和抗体的结合，且色素的颜色影响免疫组织化学染色结果的观察和判读，给病理诊断带来严重的影响。有效地去除黑色素且不影响后续检测是富含黑色素病变正确诊断的前提。目前有多种去除黑色素颗粒的方法[1,2]，如过氧化氢脱色法、过氧化氢联合高锰酸钾等，但大都脱色效果欠佳。我们通过试验比较多种脱色方法，以探讨更加快速，高效和满意的脱色素方法，满足临床病理诊断的需要。

材料与方法

1 病例选择

选取我院2014年1月至2019年12月经病理确诊的20例恶性黑色素瘤，均为富含黑色素颗粒恶性黑色素瘤病例，选5例无色素性恶性黑色素瘤作为对照。

2 试剂

高锰酸钾和30%过氧化氢为广州化学试剂厂产品。一抗：单克隆抗体HMB45（批号：ZM-0187）、Melan-A（批号：ZM-0398）及CK（批号：ZM-0069）均购自北京中杉国际有限公司；二抗为 Envision免疫组织化学试剂盒购自丹麦DAKO公司。

3 褪色试剂配制方法

0.25%高锰酸钾：0.25g高锰酸钾溶液+蒸馏水100ml；0.5%高锰酸钾：0.5g高锰酸钾+蒸馏水100ml；10%过氧化氢溶液：30%过氧化氢30ml+蒸馏水60ml；15%过氧化氢溶液：30%过氧化氢50ml+蒸馏水50ml。

4 褪色方法

按脱色素方法分为A、B、C、D 4组。0.5%高锰酸钾水浴法（A组）：组织切片经0.5%高锰酸钾溶液，55℃水浴加热4min，1%草酸溶液处理1s×3次。0.25%高锰酸钾溶液滴入法（B组）：0.25%高锰酸钾溶液滴入切片，常温下15～45min，其间视色素脱失情况结束处理时间。15%过氧化氢浸泡法（C组）： 15%过氧化氢浸泡切片30min后，0.5%高锰酸钾液室温浸泡5min。传统过氧化氢脱色法[1]（D组）：用10%过氧化氢液处理切片24～48h。

5 染色

所有组织标本经10%中性甲醛固定，常规脱水、透明和石蜡包埋成石蜡组织标本，切片3µm厚各16张，每组4张，用涂抹多聚赖氨酸玻片捞片，烘干。切片经脱蜡、水洗后分别按不同褪色方法处理，脱颗粒处理后进行HE染色和免疫组织化学染色，免疫组化采用Envision二步法。

结 果

4组脱色素方法染色效果见表1。HE染色显示肿瘤组织富含色素（图1A），以B组方法的退色素结果较理想，切片色素颗粒去除充分，切片完整，组织形态和细胞结构清晰（图1B）；免疫组织化学染色结果清晰易判读，且显示较强的敏感性和特异性（图1C）。A组、C组和D组均有不同程度的缺陷，如组织结构和细胞形态模糊、免疫组织化学染色时切片易脱落、免疫组织化学反应产物定位差等（图1D）。

图1 不同脱色素方法处理恶性黑色素瘤组织HE和免疫组织化学染色效果比较。A，0.5%高锰酸钾水浴法脱色素，HE染色，富含黑色素；B，脱色素，HE染色，色素颗粒去除充分，染色效果好；C，0.25%高锰酸钾溶液滴入法脱色素，HMB45免疫组织化学染色，染色清晰易判读，敏感性和特异性较强；D，10%过氧化氢法脱色素，HMB45免疫组织化学反应产物定位差；比例尺，100μmFig. 1 Comparison of HE and immunohistochemical staining results of malignant melanoma tissues treated with different depigmentation methods. A,the section depigmented with the 0.5% potassium permanganate water bath method showed still rich in melanin when stained with HE; B, the section depigmented with the 0.25% potassium permanganate solution dropping method showed sufficient removal of the pigment particles and good HE staining effect; C, the section depigmented with the 0.25% potassium permanganate solution dropping method showed clear image which was easy to interpret when stained with HMB45; D, the section depigmented with the 10% hydrogen peroxide method showed poor localization when stained with HMB45; scale bar, 100μm

表1 4种脱色素方法染色效果比较Tab.1 Comparison of staining effects of four groups of depigmentation method

讨 论

恶性黑色素瘤是临床病理诊断中常见的肿瘤，由于其病理形态的结构多样性，需要与各种非黑色素性恶性肿瘤、痣或交界性病变鉴别。恶性黑色素瘤的黑色颗粒在电镜下为特征性黑素体，对诊断具有决定性意义[4]，但因各个病理科条件所限或对取材特殊要求，并非病理常规检测手段。由于恶性黑色素瘤起源于皮肤的黑色素细胞，黑色素颗粒是一种高分子生物色素，是由酪氨酸，多巴胺和酪胺等物质合成，其颗粒在常规病理制片中不易溶解，在HE切片染色中，这些颗粒掩盖细胞形态、结构模糊不清，无法观察细胞核的异型性变化、有无核仁以及核分裂像等的计数，影响正确的病理诊断及分型。免疫组织化学染色黑色素瘤细胞特殊标记抗体HMB45和Melan-A有助于病变的正确诊断与鉴别诊断[5]。因此，去除恶性黑色素瘤的色素颗粒，对于HE染色切片形态观察及免疫组化染色的阳性判断，具有重要的意义。

黑色素颗粒常见于黑色素瘤和良性的痣细胞病变中，由于颗粒稳定，不溶于水和有机溶剂，在病理技术常规中难以去除，严重影响病理切片染色质量，尤其对免疫组化的抗原表达很难区别，目前有许多报道[2,3]尝试多种方法去除黑色素颗粒，但大都效果欠佳。本研究比较了4种脱色素方法，经两位诊断经验丰富的病理医师采用盲法分析比对，证明以0.25%高锰酸钾溶液滴入法脱色素方法比较理想，达到高效去除黑色素颗粒，组织形态清晰和不掉片，免疫组织化学染色结果清晰易判读。该方法解决了常规染色和免疫组织化学染色脱色素颗粒的难题。该方法由于在处理上采用低浓度高锰酸钾，脱色素时间短，并在镜下动态观察脱色素颗粒的过程，使切片不至于因过度的浸泡而产生掉片。此方法处理过程简单且时间短，易于在常规临床工作中推广使用。