LncRNA MEG3调控miR-328影响类风湿性关节炎滑膜细胞增殖、凋亡和炎性反应

段毅，易谭勇，朱乐全，周中丽

（1重庆市黔江中心医院骨科，2重庆市黔江中心医院呼吸内科，重庆，409099）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以炎性滑膜炎为主的慢性和进行性全身免疫系统疾病，患病人群中女性多于男性[1]。其特征是多关节受累、畸形，并常伴有关节外器官受累等[2]。目前治疗方法包括药物治疗、免疫疗法、外科治疗和功能锻炼等，近些年，靶向治疗成为了研究热点，以期寻找治疗RA更好的方法和策略[3]。

长链非编码RNA（long non coding RNA, lncRNA）和微小RNA （miRNA）均为非编码RNA，参与多种细胞或疾病的生理过程，能对炎症和自身免疫进行调节[4]。现有研究表明，lncRNA和miRNA的失调与RA的发病密切相关[5]。例如，LncRNA-COX2在RA患者外周血液中的表达量明显升高[6]。长链非编码RNA母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是一种印记基因，定位于染色体14q32.3，编码长度为～1600个nt的长链非编码RNA的表达，是多种肿瘤的抑制基因[7]。lncRNA MEG3在RA中通常能够起到保护骨关节的作用，过表达lncRNA MEG3可以降低NLRC5和炎性细胞因子的表达水平，从而对RA产生影响；下调lncRNA MEG3可通过STAT3途径促进成纤维样滑膜细胞的增殖和侵袭，抑制细胞凋亡[8,9]。

大量研究表明，miRNAs的表达参与多种疾病的进展，其在RA的发展过程中也起着多方面的作用[10]，miR-141-3p被证明可以抑制RA滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭从而影响RA的进程[11]。miR-328可直接抑制MMP-16进一步抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移，促进细胞凋亡[12]，但miR-328影响RA的机制尚未明确。

本研究试探讨LncRNA MEG3作为分子海绵吸附miR-328，对RA滑膜细胞增殖、凋亡以及炎性反应产生调控作用的机制。

材料与方法

1 试剂与仪器

RNA提取试剂盒（10296010）、Lipofectamine 3000（L3000-015）、无血清培养基Opti-MEMI（31985-070）购自Invitrogen公司；PrimeScriptRT试剂盒（RR014A）购自宝日医生物科技公司；PCR试剂盒（KR011A1）购自北京天根生化科技有限公司；荧光原位杂交试剂盒（C10910）购自RIBOBIO；LncRNA MEG3的寡核苷酸探针购自Sangon Biotech，LncRNA探针和阴性对照（NC）探针的序列分别为CCCAGTCAACACTCATACTT、CCATCCTATACCAATCTCGA；双荧光素酶报告试剂盒（E2920）、Luminometer荧光检测仪（Glomax20/20）购自Promega；DMEM培养基（90113）、ELISA试剂盒TNF-α（SEKH-0047）、IL-6（SEKH-0013）、IL-10（SEKH-0018）以及RIPA裂解液（R0010）均购自北京索莱宝科技有限公司；BCA试剂盒（23227）购自Thermo Fisher；一抗兔抗人Fas（ab82419）、Bax（ab32503）、Bcl-2（ab32124）、PCNA（ab29）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（ab150077）以及Annexin V-FITC/PI试剂盒（ab14085）均购自Abcam公司；Matrigel基质胶（40111ES08）购自Sigma公司；细胞转染序列由华大基因合成；多功能酶标仪（Multiskan™ FC）购自Thermo Fisher；倒置光学显微镜（YKDZ-55）购自上海永科光学仪器有限公司；流式细胞仪（CytoFLEX）购自贝克曼库尔特；Bio-Rad ChemiDoc MP全能型成像系统来自上海伯乐生命医学产品有限公司。

2 研究对象

收集我院2017～2019年间RA患者膝关节手术取材标本45例（女31例，男14例）。年龄24～68岁（平均46.7岁），发病时间2～16个月（平均9个月）。同时收集18例非类风湿关节炎滑膜标本作为对照组。该实验中所有患者均签署实验知情同意书，并通过我院临床实验伦理委员会同意。

3 qRT-PCR检测mRNA表达水平

采用RNA提取试剂盒提取类风湿关节炎滑膜组织和正常滑膜组织总RNA，使用PrimeScriptRT试剂盒将RNA逆转录成cDNA。设计LncRNA MEG3、miR-328、Fas、Bcl-2、Bax、PCNA PCR引物，由上海吉凯基因公司合成（表1）。按PCR试剂盒操作步骤进行qRT-PCR反应，反应体系和条件均依据试剂盒说明书设定。采用相对定量法，2-△△Ct法计算目的基因mRNA的相对转录水平。检测RA滑膜细胞中相关因子的表达同样采取本方法。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

4 FISH检测和双荧光素酶报告实验

获取LncRNA MEG3互补的5’位Cy3染料标记的寡核苷酸探针，并以Cy3标记的正义寡核苷酸作为阴性对照。收集处于指数生长期的RA滑膜细胞，再悬浮获得单细胞悬液（5×104/ml）。将细胞接种到多室盖玻片中，在正常生长条件下培养过夜。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，5min后固定于4%甲醛中15min。蛋白酶K（2μg/mL）处理RA滑膜细胞，之后加入250μl的预杂交液，42℃孵育1h后将预杂交液除去，之后在RA滑膜细胞中加入250μl含有300ng/ml探针的杂交液，42℃过夜后再次PBS冲洗，之后加入PBST稀释的DAPI染液（1:800）染细胞核5min，之后PBS冲洗3次，每次3min。抗荧光淬灭剂封片后采用荧光显微镜拍照并进行观察。

生物信息学预测网站RNA22预测LncRNA MEG3和miR-328的特异性结合序列，之后通过双荧光素酶报告实验验证二者之间的靶向关系。人工合成LncRNA MEG3基因片段（GUGGGAGGAAGUAAGAAGGGCCAA）并且借助内切酶位点Hind Ⅲ以及Spel引入pMIR-reporter，依据LncRNA MEG3野生型序列设计互补的突变序列（GUCCGUCCAACUUUAGAUCCCGGUA），限制性内切酶酶切后借助T4 DNA连接酶将目的片段插入至pMIR-reporter质粒。之后将测序正确的荧光素酶报告质粒WT、MUT分别与miR-328以及NC共转染至HEK-293T细胞中，连续转染48h后收集细胞，进一步裂解细胞后借助双荧光素酶报告试剂盒以及Luminometer荧光检测仪对荧光素酶活性进行检测。荧光素酶活性为萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性的相对值。

5 细胞培养与转染

在关节腔穿刺获得无菌关节腔积液，离心，去上清，PBS冲洗，再次离心并去上清后加入含FBS的DMEM培养基。吹打混匀细胞后计数，连续培养3d后使用0.25%的胰酶消化细胞，传代后获取RA成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）用于后续转染和实验。

将第3代细胞进行转染和分组，阴性对照（negative control，NC）组（RA滑膜细胞+LncRNA MEG3的阴性对照序列）、LncRNA MEG3组（RA滑膜细胞+LncRNA MEG3）、sh-LncRNA MEG3组（RA滑膜细胞+LncRNA MEG3 shRNA）、miR-328-NC组（RA滑膜细胞+miR-328的阴性对照序列）、miR-328 mimic组（RA滑膜细胞+miR-328模拟物）、LncRNA+miR-NC组（RA滑膜细胞+LncRNA MEG3+miR-328的阴性对照序列）、LncRNA+miR-328 mimic组（RA滑膜细胞+LncRNA MEG3+miR-328模拟物）。转染步骤依据Lipofectamin 3000说明书进行。

6 炎性因子水平的ELISA法检测

使用ELISA法检测各组RA滑膜细胞转染48h后的培养液中炎性因子水平（TNF-α、IL-6、IL-10），实验操作按照试剂盒说明书进行，使用多功能酶标仪测定450 nm波长空白处的吸光值。

7 Western blot检测各组RA滑膜细胞蛋白表达水平

收集转染48h后RA滑膜细胞，分别加入RIPA蛋白裂解液裂解细胞，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白煮沸、变性，行SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转膜并置于含10%脱脂奶粉的TBST（10 mmol/L Tris-HCI，pH7.5，150 mmol/L NaCI，0.05% Tween-20）中封闭过夜。之后分别加入兔抗人Fas、Bax、Bcl-2、PCNA等一抗，室温孵育2h，PBST冲洗后加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG。37℃孵育、PBST冲洗，ECL显色后用Bio-Rad ChemiDoc MP拍摄，并用Image J软件对蛋白检测结果进行定量分析。

8 RA滑膜细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI双标染色法流式细胞术检测

将处理好的RA滑膜细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养48h，收集细胞，PBS溶液洗涤2次后离心，将细胞重悬于200μl结合缓冲液中，加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI轻轻混匀，避光室温反应15min，加入300μl结合缓冲液，用流式细胞仪以激发波长488nm检测细胞凋亡情况。

9 RA滑膜细胞增殖能力的MTT法分析

取处于对数生长期、生长状态良好的RA滑膜细胞以每孔1× 104个细胞接种于96孔培养板中，每孔培养基体积200 μL。细胞贴壁24h，37℃、5%CO2培养箱中继续培养至24、48及72h，每孔加20μl MTT溶液（5mg/ml），37℃孵育4h，弃上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10min，酶标仪测490nm各孔光吸收值OD，实验重复3次，取3次结果的平均值。

10 RA滑膜细胞侵袭力的Transwell分析

转染48h后的RA滑膜细胞于无血清培养基中饥饿12h后消化，PBS冲洗2遍，用含10g/L牛血清蛋白（BSA）的无血清培养基Opti-MEMI重悬细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml。实验采用24孔板8μm Transwell小室，每组3个小室，实验前在小室铺50μl Matrigel基质胶，48h后在Transwell小室上室分别加入各组细胞的单细胞悬液200μl（4×104个细胞），而小室下室加入650μl含10% FBS的G-DMEM培养液，置于37℃、5% CO2培养箱培养12h。后取出小室，PBS淋洗后，放于甲醇溶液中，室温固定30min，再用0.1%结晶紫染色20min，使用棉签轻轻擦去微孔膜上层的细胞。在倒置光学显微镜下观察并且采集图像，随机选择4个视野，对穿过微孔膜的细胞进行计数，计算平均值。实验重复3次。

11 统计学分析

所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件（USA）进行处理，计量资料采用均值 ± 标准差的形式表示，两组间比较为t检验，多组间的比较应采用单因素方差分析。P< 0.05表示差异具有显著性统计学意义。

结 果

1 类风湿关节炎滑膜组织中LncRNA MEG3水平下降和miR-328水平增高

利用qRT-PCR对RA和正常滑膜组织中LncRNA MEG3和miR-328的表达进行检测发现，相对于健康对照组，RA组中LncRNA MEG3水平显著下降而miR-328水平显著升高（图1）。

图1 RA滑膜组织中LncRNA MEG3和miR-328表达水平qRT-PCR检测。A，LncRNA MEG3在类风湿关节炎滑膜组织中的表达；B，miR-328在类风湿关节炎滑膜组织中的表达。与Control相比：**P<0.01（n=45）Fig. 1 qRT-PCR detection of the expression level of LncRNA MEG3 and miR-328 in the synovial tissues of RA. A, the expression of LncRNA MEG3 in the synovial tissues of RA; B, the expression of miR-328 in the synovial tissues of RA. Compared with control group: **P<0.01 (n=45)

2 miR-328靶向滑膜细胞LncRNA MEG3

FISH检测显示，LncRNA MEG3主要定位于RA滑膜细胞胞质（图2A），提示LncRNA MEG3可稳定发挥竞争性内源RNA的功能。RNA22网站显示LncRNA MEG3和miR-328存在特异性结合位点（图2B）；双荧光素酶报告实验分析显示，相对于miR-328 NC对照组，miR-328 mimic显著抑制MEG3-WT的荧光活性，而对MEG3-MUT的荧光活性几乎没有影响（图2C）。

图2 RA滑膜细胞中miR-328与LncRNA MEG3的靶向关系分析。A，LncRNA MEG3表达的FISH检测（比例尺，25μm）；B，miR-328与LncRNA MEG3靶向关系的RNA22网站预测结果；C，miR-328与LncRNA MEG3靶向关系的双荧光素酶报告基因分析结果。与miR-328 NC组相比：**P<0.01；n=3Fig. 2 The targeting relationship between LncRNA MEG3 and miR-328 in the RA fibroblast-like synoviocytes. A, FISH examination of LncRNA MEG3 expression in the RA fibroblast-like synoviocytes (scale bar, 25μm); B, RNA22 website prediction result of the targeting relationship between LncRNA MEG3 and miR-328; C, dual-luciferase reporter gene assay of the targeting relationship between LncRNA MEG3 and miR-328. Compared with miR-328 NC group: **P<0.01; n=3

3 LncRNA MEG3抑制RA滑膜细胞炎性因子表达

ELISA分析显示，相对于LncRNA NC组，LncRNA MEG3组RA滑膜细胞培养基中TNF-α、IL-6水平显著降低，IL-10水平显著增强，而sh-LncRNA MEG3组RA滑膜细胞培养基中TNF-α、IL-6水平增强，IL-10水平降低（图3）。

图3 LncRNA MEG3对RA滑膜细胞上清液中炎性因子表达水平影响的ELISA检测。与NC组相比：#0.01

4 LncRNA MEG3促进RA滑膜细胞凋亡

为进一步探究LncRNA MEG3在RA中的作用，采用流式细胞术检测LncRNA MEG3对RA滑膜细胞凋亡的影响。结果显示：相对于NC组，LncRNA MEG3组中细胞凋亡率显著升高，而下调LncRNA MEG3则减少了细胞凋亡（图4A、B）。对细胞凋亡相关因子Fas、Bcl-2和Bax 的Western blot检测显示，LncRNA MEG3表达上调后，Bcl-2水平降低，而Fas和Bax水平增高，抑制LncRNA MEG3效果则相反（图4C、D）；进一步的qRT-PCR检测显示，上调LncRNA MEG3表达能显著下调Bcl-2 mRNA表达、上调Fas、Bax mRNA表达，抑制LncRNA MEG3则相反（图4E）。由此表明LncRNA MEG3可有效促进RA滑膜细胞凋亡（图4）。

5 LncRNA MEG3抑制RA滑膜细胞增殖和侵袭

应用Transwell和MTT检测LncRNA MEG3对RA滑膜细胞增殖和侵袭的影响。Transwell实验显示，与NC组相比，LncRNA MEG3能够显著抑制RA滑膜细胞的侵袭，沉默LncRNA MEG3则对RA滑膜细胞的侵袭具有促进作用（图5A，B）。MTT分析显示，LncRNA MEG3能够显著抑制RA滑膜细胞的增殖，而抑制其表达则相反（图5C）。对细胞增殖相关因子PCNA的Western blot检测显示，LncRNA MEG3表达上调后，PCNA水平降低，而抑制LncRNA MEG3后，PCNA水平增高（图4C、D）；进一步的qRT-PCR检测显示，上调LncRNA MEG3表达能显著下调PCNA mRNA表达，抑制LncRNA MEG3则上调其表达（图4E）。

图4 LncRNA MEG3促进RA滑膜细胞凋亡且抑制细胞增殖相关因子表达。A，细胞凋亡代表性流式细胞术检测结果；B，细胞凋亡率统计学分析；C，胞凋亡相关因子及细胞增殖相关因子代表性Western blot检测结果；D，细胞凋亡相关因子及细胞增殖相关因子水平统计学分析；E，胞凋亡相关因子及细胞增殖相关因子mRNA表达水平的qRT-PCR检测。与NC组相比：*0.01

图5 LncRNA MEG3对RA滑膜细胞增殖和侵袭的影响。A，细胞侵袭力代表性Transwell检测结果（比例尺，50μm）；B，细胞侵袭力统计学分析；C，细胞增殖活力MTT检测和统计学分析。与NC组相比：*0.01

6 miR-328部分逆转LncRNA MEG3对RA滑膜细胞炎性因子表达的抑制

ELISA检测显示，上调miR-328的表达可显著提高RA滑膜细胞的促炎因子（TNF-α和IL-6）水平，并降低抗炎因子IL-10水平。为了进一步探究LncRNA MEG3和miR-328在RA中的作用机制，将LncRNA MEG3和miR-328 mimic共转染RA滑膜细胞后检测TNF-α、IL-6和IL-10水平。相对于miR-328-NC组，LncRNAMEG3+miR-NC组中炎性因子TNF-α和IL-6水平降低而IL-10水平增高，LncRNA MEG3和miR-328 mimic共转染组则相反。这些结果表明，miR-328在RA中可发挥促炎作用，并能部分逆转LncRNA MEG3对RA滑膜细胞炎性因子的影响（图6）。

图6 miR-328对LncRNA MEG3抑制RA滑膜细胞炎性因子作用的影响。与miR-328-NC组相比：*0.01

7 miR-328部分逆转LncRNA MEG3对RA滑膜细胞凋亡的促进

应用流式细胞术检测了LncRNA MEG3调控miR-328对RA滑膜细胞凋亡的影响。相对于miR-328-NC组，LncRNAMEG3+miR-NC组凋亡显著增多，而上调miR-328 mimic可使凋亡减少（图7A，B）。进一步细胞凋亡相关因子Fas、Bcl-2和Bax蛋白与mRNA水平进行Western blot和qRT-PCR检测发现，上调LncRNA MEG3表达，Bcl-2表达降低，Fas和Bax表达增强，而miR-328 mimic则部分抑制这一作用（图7C — E），提示LncRNA MEG3对RA滑膜细胞凋亡的促进作用可被miR-328 mimic部分逆转。

8 miR-328部分逆转LncRNA MEG3对RA滑膜细胞增殖和侵袭的抑制

Transwell和MTT实验数据显示，过表达LncRNA MEG3可显著抑制RA滑膜细胞侵袭和增殖，而上调miR-328则对RA滑膜细胞的侵袭和增殖具有促进作用。LncRNA MEG3和miR-328 mimic共转染后，LncRNA MEG3对RA滑膜细胞增殖和侵袭的抑制作用能够被miR-328部分逆转（图8）。进一步对细胞增殖相关因子PCNA蛋白和mRNA水平进行Western blot和qRT-PCR检测发现，上调LncRNA MEG3表达，PCNA表达降低，而miR-328 mimic则部分减弱这一作用（图7C — E），提示LncRNA MEG3对RA滑膜细胞增殖的抑制作用可被miR-328 mimic部分逆转。

图7 miR-328逆转LncRNA MEG3对RA滑膜细胞凋亡的促进和增殖相关因子表达的抑制。A，细胞凋亡代表性流式细胞术检测结果；B，细胞凋亡率统计学分析；C，细胞因子水平代表性Western blot检测结果；D，细胞因子水平Western blot检测结果的统计学分析； E，细胞因子mRNA qRT-PCR检测结果的统计学分析。与miR-328-NC组相比：*0.01

图8 miR-328对LncRNA MEG3抑制RA滑膜细胞增殖和侵袭作用的影响。A，代表性侵袭检测结果；B，侵袭数目统计学分析；C，细胞增殖活力统计学分析。与miR-328-NC组相比：*0.01

讨 论

在RA中，滑膜组织通常会出现增生，进而产生炎性反应，甚至出现滑膜成纤维细胞的肿瘤样侵袭和转移，破坏关节[13]。先前治疗RA的一线药物非甾体抗炎药副作用强、预后效果差，近些年，随着抗风湿药物的早期联合应用，以及生物制剂、免疫疗法、靶向治疗等新方法的研究与应用，多数RA患者的病情可以得到很好的控制，预后效果也有很大改善[14,15]。继续研究和开发新药物、新方法，以期更大程度上为RA患者减轻痛苦，仍然是我们的使命和职责所在。

LncRNAs可以作为分子海绵竞争性吸附miRNAs，抑制其与下游mRNAs靶向结合，从而抑制其进一步对细胞生理活动或者疾病病理过程产生影响[16]。有研究发现，LncRNAMEG3在RA患者中表达下调，下调LncRNAMEG3可以促进RA滑膜细胞增殖和侵袭[8]。与前人结果一致，本研究发现，在RA滑膜组织中，LncRNA MEG3表达量下降，并且上调其表达量能够降低炎性因子的浓度，抑制RA滑膜细胞增殖和侵袭，促进凋亡；而沉默其表达，则会出现相反的效果。

miRNAs能够调控细胞的分化，从而在疾病中发挥作用，但是其表达可能受到上游LncRNAs的调控，例如，Ji Y等发现敲除LncRNA BLACAT1基因能促进miR-142-5p表达，从而促进靶向炎性骨髓基质干细胞的增殖和成骨分化，有利于骨关节炎的治疗[17]。本研究证实了LncRNA MEG3与miR-328之间存在靶向关系，且二者的表达量呈负相关。现有研究表明，miR-328在疾病中通常产生不利影响，Chen Ruisong等发现miR-328-3p能抑制成骨细胞分化，促进骨质疏松症的发展；Zhao Dandan等发现miR-328能促进心肌纤维化，加速心肌梗塞[18,19]。本研究发现，miR-328在RA滑膜组织中表达增强，并且它的过表达能够增加炎性因子的浓度，促进RA滑膜细胞的增殖和侵袭，抑制其凋亡。miR-328的过表达能够部分挽救LncRNA MEG3对RA滑膜细胞产生的影响。

综上所述，LncRNA MEG3能够作为分子海绵竞争性吸附miR-328，抑制其表达，从而抑制RA滑膜细胞炎性因子的表达，减少RA滑膜细胞的增殖和侵袭并诱导其凋亡，有利于RA的治疗。