内质网应激介导小鼠急性汞中毒性肝损伤

胡珊，张雨淼，王保强，陈龙，张倩，张红霞*

（1潍坊医学院基础医学院临床病理系； 2潍坊医学院神经疾病与再生修复实验室； 3潍坊医学院附属医院肾内科； 4潍坊医学院附属医院检验科，潍坊 261053）

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）参与多种疾病的发生发展，且有研究表明ERS与肝疾病有关。脂多糖与氨基半乳糖联合作用可通过激活自噬和ERS导致急性肝损伤[1]。乙醇诱导小鼠丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高且明显激活肝ERS[2]。汞作为一种有毒重金属，可对机体多系统造成严重的损害，包括中枢神经系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统、免疫系统等，其对肝与肾的损伤尤为明显[3]。甲基汞处理原代培养的皮层神经元中，葡萄糖调节蛋白（GRP78，GRP94）上调、转录因子4（ATF4）和C/EBP同源转录因子蛋白升高，ERS被激活[4]。前期研究发现，急性HgCl2中毒可通过ERS介导引起肾脏损伤，且呈明显剂量依赖性[5]。此外，急性氯化汞中毒会引起急性肝损伤，肝细胞发生变性坏死、中央静脉改变、炎细胞浸润等[6]，但其损伤机制并不完全明确。因此本研究旨在探讨急性氯化汞中毒是否通过ERS引起急性肝损伤。

材料与方法

1 试剂

氯化汞（HgCl2）购于美国Sigma-Aldrich公司；4-苯基丁酸钠盐（4-sodium phenylbutyrate，4-PBA）购自美国Selleck公司；HE染色试剂盒购自中国Solarbio公司；兔抗Bip及鼠抗GAPDH均购于美国Cell Signaling Technology公司；鼠抗CHOP购自美国Santa Cruz公司；DAB显色试剂盒与通用二步法试剂盒（小鼠/兔增强聚合物法检测系统）PV-9000购于北京中杉金桥公司；HRP标记羊抗兔IgG二抗与HRP标记羊抗小鼠IgG二抗购于武汉proteintech公司。

2 动物与造模

本研究所进行动物实验严格遵守《山东省实验动物管理委员会标准》及《潍坊医学院实验动物使用及护理指南》的规定。8周龄健康雄性C57BL/6小鼠（济南朋悦实验动物繁育有限公司），SPF级饲养，自由饮水，光照白天11h，夜间13h，温度25℃。小鼠随机分为对照组、HgCl2染毒组、4-PBA+HgCl2组，每组各6只。对照组不做任何处理，HgCl2染毒组通过腹腔注射8mg/kg HgCl2，4-PBA+HgCl2组提前两天腹腔注射20mg/kg 4-PBA后，注射8mg/kg HgCl2。

3 小鼠肝功能检测

染毒16h后称量小鼠体重，5%水合氯醛麻醉后经眼球取血，低温高速离心分离血清，使用全自动生化分析仪检测小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）与谷草转氨酶（AST）水平。处死小鼠，留取肝脏组织。

4 HE染色

5%多聚甲醛固定小鼠肝脏组织，经石蜡包埋，行连续切片（厚4μm）；二甲苯脱蜡，逐级酒精水化，苏木素复染，1%盐酸酒精分化液分化、1%氨水蓝化液返蓝，伊红染液染色，自来水浸泡，脱水、透明，中性树胶封片，显微镜观察。

5 免疫组织化学

石蜡切片经60℃烤箱烤片2h；二甲苯脱蜡，逐级酒精入水；内源性过氧化物酶阻断剂37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min；柠檬酸抗原修复液微波修复13min，PBS洗3次；10%山羊血清于37℃孵育30min；Bip（1:300）、CHOP（1:100）4℃孵育过夜；依次滴加反应增强液及增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物37℃孵育40min，PBS洗3次；DAB显色4min后苏木素复染核；脱水透明，树胶封片，镜下观察。

6 Western blot

提取小鼠肝脏组织总蛋白，并进行BCA蛋白定量。依次经过SDS-PAGE电泳分离、转膜、5%脱脂牛奶封闭后，滴加相应一抗（Bip：1:1000；CHOP，1:1000）于4℃孵育过夜；次日二抗（1:4000）室温孵育2h；ECL化学发光法显影，化学发光仪（美国BIO-RAD，cat. #1708374）曝光，使用Image J软件对各条带进行分析，以目的蛋白条带与内参照GAPDH条带积分光密度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

7 统计学处理

采用SPSS 25.0 统计软件进行相关分析，各组数据均以¯x ± s表示，每组计量数据间采用独立样本t检验，使用GraphPad Prime 6及IPP 6.0处理图像，以P< 0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1 4-PBA预处理可减轻急性汞中毒肝功能损伤

对照组小鼠ALT与AST水平均在正常范围之内（ALT: 0～40U/L; AST：0～160U/L）。与对照组相比，8mg/kg HgCl2染毒组ALT与AST水平明显升高，表明急性HgCl2染毒16h后小鼠肝脏功能明显受损。4-PBA预处理后，可明显改善急性HgCl2引起的肝脏功能损伤，ALT与AST水平HgCl2染毒组明显降低（图1）。以上结果表明急性汞中毒可引起明显的肝功能受损，4-PBA作为ERS的一种特异性阻断剂，预处理后可以减轻急性汞中毒引起的肝功能损伤。

图1 4-PBA预处理对急性HgCl2暴露肝功能损伤的影响。A，谷丙转氨酶（ALT）水平；B，谷草转氨酶（AST）水平；与Ctrl组相比，*P<0.01；与HgCl2染毒组相比，#P<0.01；n=6Fig 1 Effect of 4-PBA pretreatment on liver function injury caused by acute HgCl2 exposure. A, ALT levels; B, AST levels; *P<0.01, compared with Ctrl group; #P<0.01, compared with HgCl2 group; n=6

2 4-PBA预处理减轻急性汞中毒肝组织

HE染色结果显示，对照组小鼠肝脏结构清晰，肝细胞索排列正常，肝窦无明显扩张，汇管区少量淋巴细胞浸润；HgCl2染毒组，肝索排列紊乱，肝细胞水肿，肝窦变窄，汇管区浸润的淋巴细胞增多；4-PBA预处理后，肝细胞水肿明显改善。表明抑制ERS能够明显减轻急性汞中毒引起的肝脏形态学损伤（图2）。

图2 HgCl2暴露及4-PBA预处理对肝组织学的影响。比例尺，20μmFig. 2 Effect of HgCl2 exposure and 4-PBA pretreatment on the histology of liver tissues. Scale bar, 20μm

3 4-PBA预处理抑制急性汞中毒时肝组织ERS

Bip与CHOP是ERS特异性蛋白，表达升高表明ERS增加。免疫组织化学检测表明，对照组Bip与CHOP免疫反应性极弱；而与对照组相比，HgCl2染毒组肝细胞内Bip与CHOP免疫反应性明显增强，且免疫反应阳性产物主要集中在细胞质；与HgCl2染毒组相比，4-PBA+HgCl2组Bip与CHOP免疫反应性显著降低（图3）。进一步的Western blot检测显示，与Ctrl相比，HgCl2组Bip与CHOP水平显著升高，而4-PBA预处理组Bip与CHOP水平明显降低。以上结果说明，4-PBA预处理明显降低HgCl2诱导的Bip及CHOP水平在肝组织中的上调（图4）。

图3 4-PBA预处理对急性HgCl2暴露后肝组织内内质网应激相关蛋白影响的免疫组织化学检测。A，代表性Bip和CHOP免疫组织化学染色结果；比例尺，50μm。B和C，Bip（B）和CHOP（C）免疫反应性统计学分析；与Ctrl组相比，*P<0.01；与HgCl2染毒组相比，##P<0.01，#0.01

图4 4-PBA预处理对急性HgCl2暴露后肝组织内内质网应激相关蛋白表达影响的Western blot检测。A， Bip和CHOP水平的代表性Western blot检测结果。B和C，Bip（B）和CHOP（C）水平的统计学分析；与Ctrl组相比，*P<0.01；与HgCl2染毒组相比，##P<0.01，#0.01

讨 论

汞是一种极易挥发的应用广泛的有毒重金属，普通人短时内吸入0.3～1mg/m3汞蒸气可引起急性汞中毒，2.5g汞产生的汞蒸气足以致死。不仅民间使用含汞偏方治疗顽疾可引起急性汞中毒或致死，职业性汞暴露也可引起急性汞中毒。研究表明，汞中毒可引起肝脏组织病理学损伤。雌性Wistar大鼠暴露于汞蒸气45d后，肝实质体积明显缩小，肝细胞发生变性，胞浆深染，未见核仁，且肝细胞核固缩[7]。此外，Wistar大鼠急性HgCl2中毒后，出现肝细胞变性，中央静脉与门静脉区出现大量炎症细胞浸润[6]。本研究发现，急性HgCl2中毒可引起小鼠肝细胞水肿变性，排列紊乱且肝脏功能指标ALT、AST水平明显升高。对急性HgCl2中毒引起肝脏损伤机制进行研究，有助于为鉴定急性HgCl2中毒提供理论基础，也有助于为HgCl2中毒的临床治疗提供理论依据。

当内质网受到缺血、缺氧、蛋白合成升高及药物作用等刺激时，内质网的内环境发生改变，发生ERS。适度的ERS ，细胞通过未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）恢复内质网正常的生理功能，此时Bip被激活[8]。Bip即免疫球蛋白重链结合蛋白，也称葡萄糖调节蛋白78（GRP78），是内质网的分子伴侣，可促进内质网对错误折叠蛋白质的处理，恢复内质网的稳态。Bip表达升高是ERS的标志，长期低剂量注射HgCl2后，大鼠附睾白色脂肪组织（eWAT）中GRP78 mRNA表达增多[9]。我们通过对小鼠腹腔注射HgCl2，染毒16h后检测肝组织Bip蛋白水平发现，急性汞中毒时Bip水平显著升高，说明急性汞中毒时肝组织内出现明显的ERS。当刺激比较剧烈或持续存在时，超出UPR的阈值，将会通过CHOP信号通路诱导细胞凋亡。C/EBP同源蛋白（CHOP）是一种转录因子，也是ERS的关键因子。衣霉素处理肝癌细胞，ERS特异性蛋白GRP78、GRP94及CHOP显著上调，而特异性敲除CHOP后，ERS诱导的肝细胞凋亡水平降低[10]，表明ERS可引起CHOP增多并激活细胞凋亡。我们的结果显示，HgCl2染毒16h后，CHOP水平明显上调，表明HgCl2染毒后可以激活肝脏ERS。

4-PBA是ERS特异性抑制剂，可抑制急性肺损伤中LPS诱导的ERS[11]。为了进一步验证急性HgCl2中毒是否通过诱导ERS而引起肝损伤，加入4-PBA抑制ERS信号转导途径，以观察是否能减轻HgCl2诱导的急性肝损伤。结果表明，经过4-PBA预处理可明显抑制HgCl2诱导的ERS分子伴侣Bip及CHOP水平的上调。此外，肝细胞局灶坏死、炎细胞浸润及肝功能损害都明显改善。由此证明急性HgCl2中毒引起肝脏损伤的机制与ERS有关。

综上所述，ERS在急性HgCl2中毒导致的肝损伤中发挥一定作用，抑制ERS可以对HgCl2诱导的肝损伤发挥保护作用，说明急性HgCl2中毒可能通过激活ERS调控Bip及CHOP的表达引起肝损伤，但对具体下游作用途径及方式尚不清楚，这也是我们下一步的研究内容。本研究为鉴定急性HgCl2中毒引起肝脏损伤及临床治疗急性汞中毒提供了新的理论基础和依据。