TRPC3/6/7通道在氧糖剥夺星形胶质细胞凋亡中的作用

刘阳生，陈晓云，邱堃，王静，姚华宁，廖燕宏

（1咸宁市第一人民医院 咸宁 437000 ；2武汉市第一医院 武汉 430030；3华中科技大学同济医学院 武汉430030）

中枢神经系统中，星形胶质细胞约占大脑总体积50%[1]。星形胶质细胞为神经元提供能量与营养支持，调节突触活性，还可以调节神经元内外离子、水以及神经递质的平衡，影响神经元的电活动。星形胶质细胞的这些特点决定其在脑缺血过程中的重要作用。神经元对脑缺血较敏感，此时星形胶质细胞能为神经元提供营养支持与缓冲作用[2,3]，能促进缺血期神经元的存活，以及缺血后期神经轴突生长和再生[4]。经典瞬时受体电位（transient receptor potential canonical, TRPC）是最早被鉴定且与果蝇瞬时受体电位（transient receptor potential, TRP）通道同源性最高的通道，按照序列的同源性，6种TRPC被划分为TRPC1、TRPC4/5、TRPC3/6/7 3个亚家族[5]。众所周之，钙库操纵性钙内流（store-operated calcium entry, SOCE）通道在非兴奋性细胞的钙信号调节中很重要[6]。TRPC通道在调节星形胶质细胞的激活、调节突触形成、调节神经元活性中起重要作用[7,8]。本研究通过体外培养鼠大脑皮质原代星形胶质细胞，采用氧糖剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）的方法体外模拟脑缺血再灌注的病理过程，采用野生型（WT）小鼠与TRPC3/6/7基因敲除小鼠原代培养的星形胶质细胞制备OGD/R模型，通过观察星形胶质细胞凋亡及钙内流的变化，探讨TRPC3/6/7在OGD/R过程中对星形胶质细胞凋亡的影响，同时通过流式细胞术分析和凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平变化的检测，探讨TRPC3/6/7在OGD/R过程中促进星形胶质细胞凋亡可能的作用机制，为进一步探讨促进脑缺血再灌注后星形胶质细胞凋亡的原因提供实验依据。

材料与方法

1 动物

TRPC3/6/7基因敲除鼠来自美国NIH/NIEHS Birnbaumer实验室。

2 试剂

DMEM/F12培养基购自Hyclone公司，FBS血清购自Gibco公司，兔抗Bcl-2、兔抗Bax购自CST公司，兔抗GFAP购自Abcam公司，羊抗兔IgGCY3购自CST公司 、羊抗兔 IgG-HRP购自CST公司、羊抗鼠 IgG-HRP购自CST公司， Tg、Fura 2-AM购自Invitrogen公司。凋亡检测试剂盒购自碧云天生物制剂公司。

3 实验设计及分组

将星形胶质细胞分为3组：①野生型对照组（WT-Con）；②野生型氧糖剥夺组（WT-OGD/R）；③TRPC3/6/7基因敲除氧糖剥夺组（TRPC3/6/7-/--OGD/R)。

4 星形胶质细胞的分离、培养

选取出生3d以内的乳鼠，断头取脑置于4℃ DHanks中，用眼科弯镊摘除大脑半球，仔细剥离海马、脑膜和血管等纤维成分，分离两侧大脑皮质移入EP管内，用眼科剪充分剪碎，加入1ml 0.25 %胰酶消化15min，每5min震荡一次，用混有10% FBS的DMEM-F12终止消化，用吸管反复轻轻吹打，混匀至无明显组织块，吸取液体过200目筛网后1000r/min离心5min，弃上清液，加入混有15% FBS的DMEMF12重悬，接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，于37℃、5% CO2培养箱孵育1h，翻转瓶子吸出液体以除去贴壁的成纤维细胞，将细胞悬液移至一新的培养瓶中，24h后全量换液，以后3d换液一次。9d后待细胞生长分层，将培养瓶放入37℃摇床260r/min摇晃18h，弃除小胶质细胞和少突胶质细胞，用温D-Hanks漂洗细胞，用0.25%胰酶消化、传代，减半接种，待37℃培养箱培养3～5d铺满瓶底，消化、传代，一半细胞接种继续培养，其余细胞接种于盖玻片，免疫荧光法鉴定星形胶质细胞。

5 星形胶质细胞的鉴定

将传代后的第2代星形胶质细胞接种于盖玻片上，24h后经PBS漂洗后，置于4%多聚甲醛中浸泡固定30min；细胞标本用PBS漂洗3次，每次10min；0.1%Triton X-100滴于细胞上破膜5min；PBS漂洗3次，每次10min；将10%的羊血清滴于细胞标本上封闭30min；3%BSA 稀释一抗，配制成兔抗GFAP工作浓度（1:500），一抗滴覆于细胞标本上，4℃孵育过夜；PBS漂洗盖玻片3次，每次10min；CY3标记的羊抗兔（1:2000）避光孵育2h；孵育后PBS漂洗3次，每次10min；将盖玻片倒扣于处理过的载玻片上，甘油封片，于激光共聚焦显微镜下观察拍照。

6 氧糖剥夺/复氧模型的建立

当细胞密度达到80%时，将其传至6cm塑料培养碟中，细胞贴壁后，将原培养基倒掉，PBS漂洗，加入缺氧液，然后放入自制缺氧装置中，一根管连接混有95% N2+ 5% CO2混合气的空气罐作为进气管，出口连接真空泵，缺氧装置放置于37℃恒温水箱内，真空泵抽出装置中气体，进气口通入同体积95% N2+ 5% CO2混合气。OGD组换成缺氧液在缺氧盒中氧糖剥夺6h（37℃），1h后换15% FBS的DMEM-F12培养基，Control组整个过程使用完全培养基培养，不进行缺氧处理。

7 星形胶质细胞OGD/R模型的评价

使用台盼蓝染色法测定细胞死亡率, 台盼蓝以PBS配制成4%的母液，储存于4℃，使用时稀释成0.4%的工作液。测定时，制备单细胞悬液。并作适当稀释（106细胞/ml），取9滴细胞悬液移入EP管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀，活细胞不被染色。在3min内，用计数板分别计数活细胞和死细胞。细胞死亡率计算：细胞死亡率（%）＝死细胞数/（活细胞数＋死细胞数）×100%。

8 流式细胞仪检测凋亡率

使用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒，通过流式细胞术检测细胞的凋亡率，收集经过和未经过OGD/R处理的细胞，使终浓度为1×105细胞/ml（每组8ml），加入500μl Binding Buffer悬浮细胞。然后加入AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶（PI）各5μl混匀，避光反应15min。30min内上机进行流式细胞的检测。

9 Western blotting检测Bcl-2和Bax

提取细胞蛋白：收集各组细胞，分别加适量预冷150mmol/L Lysis buffer（Cocktail）裂解液，用超声仪将细胞裂解，冰上放置5～10min，12000r/min离心30min，小心吸取上清液移植新的EP管中，用BCA定量法测定蛋白浓度。15%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白条带，将蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶-TBST室温摇床封闭1h，倒掉封闭液，加入用1×TBST稀释的一抗，兔抗小鼠单克隆抗体(Bcl-2，1:1000)，兔抗小鼠单克隆抗体(Bax，1:1000)，兔抗小鼠单克隆抗体(GFAP，1:500)，内参β-actin 、GAPDH（1:500），摇床4℃过夜。弃掉一抗后，用TBST洗膜液洗3次，每次10min，加入用TBST稀释的二抗室温孵育1h，TBST洗3次，每次10min。ECL孵育后化学发光凝胶成像仪（Bio-Rad）成像、拍照，Image J软件分析图像。

10 细胞内游离钙离子浓度测定

将生长在盖玻片上的星形胶质细胞取出，放置在灌流槽中固定好，将细胞与2μM Fura 2-AM在旧培养基中于37℃孵育40min，用预热的2mM CaCl2溶液漂洗3次，去除残留的培养基；在灌流槽中加入含有2μmo/L Fura2-AM的培养基，室温孵育40min，用2mM CaCl2溶液洗三遍，再与2mM CaCl2室温孵育15min后上机检测；将灌注槽固定在显微镜的载物台上，显微镜先观察细胞状态，选取状态较好的细胞作为检测对象，用荧光测钙系统进行检测，采用实验室常规开展的 Fura2-AM 荧光比值法。Fura2-AM（2μM）孵育细胞 40min 后用荧光测钙系统检测细胞内 Fura2 荧光，获得 F340/F380 比值变化，其大小与细胞浆 Ca2+成正比。加药顺序：60s处加50μM EGTA，120s处加50 μM EGTA+100μM OAG，240s处加2mM CaCl2+100 μM OAG，600s处结束；全程注意避光操作。

11 统计学分析

实验数据均使用 Graphad Prism 5.0 和SPSS17.0 进行统计分析。两组数据间的比较使用 Student’s t-test，数据使用平均值标准差表示，P<0.05 认为有统计学意义，P<0.01 表示两组间有明显差异。

结 果

1 星形胶质细胞纯度达95%以上

用星形胶质细胞标记物GFAP对纯化的星形胶质细胞进行鉴定，荧光显微镜下随机观察10～12个视野，计算GFAP 阳性细胞的百分率，DAPI标记细胞核，GFAP免疫染色结果显示星形胶质细胞纯度达95%以上（图1）。

图1 星形胶质细胞鉴定。用星形胶质细胞标记物GFAP免疫荧光染色（绿色），激光共聚焦显微镜下观察，示95%以上的细胞GFAP阳性；比例尺，50μmFig.1 Microphotographs of cultured astrocytes. GFAP positive cells made up more than 95% of cells shown by immunofluorescent staining. Anti-GFAP antibody was used to identify cultured rat astrocytes (green); scale bar, 50μm

2 氧糖剥夺/复氧后星形胶质细胞存活率降低

台盼蓝染色显示：与正常对照组比较，OGD/R组星形胶质细胞氧糖剥夺缺氧6h、复氧1h后96%细胞蓝染，表明OGD/R后细胞坏死率明显增高（图2）。

图2 星形胶质细胞OGD/R模型的台盼蓝染色鉴定。A，代表性台盼蓝染色结果；B，细胞坏死率统计学分析（与对照组相比：**P<0.01）Fig. 2 Assenssment of astrocyte OGD/R model by Trypan blue staining. Representative Trypan blue staining results; B, statistical analysis of cell death rate (**P<0.01, compared with control group)

3 TRPC3/6/7基因敲除降低星形胶质细胞OGD/R后Bax水平以及增加Bcl-2水平

为了比较TRPC3/6/7基因敲除是否影响OGD/R星形胶质细胞Bax和Bcl-2水平，采用Western blot法检测OGD/R后星形胶质细胞Bax和Bcl-2水平。TRPC3/6/7基因敲除鼠星形胶质细胞OGD/R后Bax水平较WT模型组明显降低（图3），而TRPC3/6/7基因敲除鼠星形胶质细胞OGD/R后Bcl-2蛋白的含量较WT模型组明显增高（图4），由此表明TRPC3/6/7基因敲除可降低星形胶质细胞OGD/R后Bax的表达，增加Bcl-2的表达。

图3 TRPC3/6/7的敲除抑制OGD/R诱导引起的Bax蛋白表达增加。*P<0.05, 与 WT-OGD/R组相比Fig.3 TRPC3/6/7-/- supressed the OGD/R-induced increase of Bax. *P<0.05, compared to WT-OGD/R group

图4 TRPC3/6/7的敲除抑制OGD/R诱导引起的Bcl-2蛋白表达减少。*P<0.05, **P<0.01,与 WT-OGD/R组相比Fig.4 TRPC3/6/7-/- suppressed the OGD/R-induced decrease of Bcl-2. *P<0.05, **P<0.01, compared to WT-OGD/R group

4 TRPC3/6/7基因敲除减少星形胶质细胞OGD/R下的钙内流。

TRPC作为一种 Ca2+通道，它参与了ROCE和ROCE操纵的SOCE,各种TRPCs 均可产生 Tg 诱导的钙库操控 Ca2+内流现象，钙影像结果显示，TRPC3/6/7基因敲除的星形胶质细胞经OGD/R 处理后，Tg刺激引起的钙内流较WT OGD/R组星形胶质细胞明显降低（图5）。

图5 TRPC3/6/7敲除减少OGD/R处理后星形胶质细胞内Tg刺激引起的钙内流。**P<0.01, 与WT-OGD/R相比较Fig.5 TRPC3/6/7-/- reduced the Tg-induced Ca2+ influx in astrocytes treated with OGD/R. **P<0.01, compared to WT group

5 TRPC3/6/7基因敲除减少星形胶质细胞OGD/R下的细胞凋亡率。

为了比较TRPC3/6/7基因敲除是否影响OGD/R星形胶质细胞凋亡率，采用流式细胞仪检测WT和TRPC3/6/7-/-鼠星形胶质细胞凋亡率，TRPC3/6/7基因敲除鼠星形胶质细胞OGD/R后细胞凋亡率较WT模型组明显降低（图6）。

图6 TRPC3/6/7敲除减少OGD/R处理后星形胶质细胞的细胞凋亡率。*P<0.05，**P<0.01, 与WT-OGD/R组相比较Fig.6 TRPC3/6/7-/- reduced the OGD/R-induced apoptosis rate of astrocytes. *P<0.05, **P<0.01, compared with WT OGD/R group

讨 论

脑卒中是一类严重危害人类生命健康，高发病率、高致死率及高致残率的中枢神经系统疾病。脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中，其中缺血性脑卒中约占80%左右。目前，脑缺血治疗除短时间内进行溶栓外尚无其它很好的治疗手段，临床上约30%的缺血性脑卒中患者由于溶栓治疗，出现血管再通现象，并伴随缺血再灌注损伤的发生。我们过去对脑缺血损伤的研究主要集中在神经元，近年来发现星形胶质细胞不仅作为传递整合体参与调节中枢神经系统的多种活动，也参与调节维持内环境的稳态，因此，星形胶质细胞在脑卒中过程中的作用也至关重要。

缺血再灌注期间发生复杂的病理生理变化包括钙超载、能量耗竭、兴奋性毒性、氧化应激、炎症和凋亡等[9-13]。几种因素相互影响、相互作用，形成了一个复杂的调控网络。缺血再灌注可挽救频临死亡的细胞，也可加重细胞损伤，导致细胞死亡。其中Ca2＋超载是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。因此，针对这一靶点研究，更有利于深入阐明脑卒中的病理机制并形成有效的治疗靶点。

TRPC蛋白家族成员中，每四个家族蛋白可形成同源或异源四聚体，四聚体组成非选择性阳离子通道，钙离子经由此通道进入细胞内。TRPC异源通道最先在同组的TRPCs成员之间形成，如TRPC3，C6，C7之间，或TRPC1，C4，C5之间[14,15]。基于TRPCs的高度序列同源性，TRPCs在除了自己形成同源性四聚体功能性SOC通道外，各亚型之间亦能形成异源性通道。

本实验建立星形胶质细胞OGD/R模型，Western blot实验结果表明，WT组星形胶质细胞OGD/R模型Bax蛋白表达增高，Bcl-2蛋白水平表达降低，TRPC3/6/7基因敲除组星形胶质细胞OGD/R模型能够下调Bax蛋白水平，上调Bcl-2的表达。因此，提示TRPC3/6/7基因敲除可下调促凋亡蛋白Bax的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提示TRPC3/6/7基因敲除可抑制脑缺血再灌注后星形胶质细胞凋亡的发生，可以对小鼠脑缺血再灌注损伤起保护作用。

TRPCs作为一种 Ca2+通道，它参与了ROCE和ROCE操纵的SOCE，各种TRPCs 均可产生Tg诱导的钙库操控 Ca2+内流现象，钙影像结果显示，TRPC3/6/7基因敲除的星形胶质细胞经OGD/R处理后，Tg刺激引起的钙内流较WT星胶OGD/R组而言，明显降低，提示TRPC3/6/7基因敲除组与WT组相比能够抑制SOCE。

因此，我们推测，TRPC3/6/7基因敲除能够抑制脑缺血再灌注损伤引起的钙内流 ，降低 Ca2＋稳态失衡在缺血性脑损伤中的作用。因此，TRPC3/6/7基因敲除抑制星形胶质细胞Ca2＋浓度的升高，并且能够下调促凋亡蛋白Bax的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提示TRPC3/6/7基因敲除可抑制脑缺血再灌注后星形胶质细胞凋亡的发生，进而影响星形胶质细胞功能，保护脑缺血再灌注损伤。为脑缺血再灌注损伤的治疗提供实验基础，同时为其药物治疗提供理论基础或药靶。