重组β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其在糖化反应中的应用

曾君瑞，潘力，王斌

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）

β-淀 粉 酶 （α-1,4-D-glucan maltohydrolase，EC3.2.1.2），是一种外切型淀粉酶[1]，可以从糖原或淀粉的非还原性末端依次切割α-1,4糖苷键，因此β-淀粉酶作用于直链淀粉时，生成麦芽糖[2,3]，而作用于支链淀粉时，由于无法切割支链淀粉分支处的α-1,6糖苷键，生成麦芽糖和极限糊精[4-6]。植物来源的β-淀粉酶主要存在于胚乳中[7]，但制备工艺复杂，成本较高，原料受季节影响明显，且酶质量不稳定；微生物来源的β-淀粉酶主要是芽孢杆菌[8,9]，如弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）[10]、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）[11]、多黏芽孢杆菌（Bacilluspolymyxa）[12]、高温产硫化氢梭状芽孢杆菌（Clostridium thermosulfurogenes）[13]和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）[14]，随着发酵工艺逐渐成熟，易达到规模化生产，可以弥补植物来源的β-淀粉酶生产上不足，但现有报道表达水平整体不高，较高的是段绪果等[15]报道的β-淀粉酶酶活为925.40 U/mL，无法满足工业生产需要，所以利用基因工程等手段表达和提高β-淀粉酶酶活水平成为研究学者关注的方向。

在啤酒酿造、制糖等工业的糖化反应中，β-淀粉酶需要保持与协同使用酶相似的作用温度和pH，以期最大程度提高麦芽糖转化率，现有研究发现B.megaterium来源的β-淀粉酶具有很好的温度耐受性和pH作用条件，满足糖化反应过程中偏酸性的要求，而其他来源的β-淀粉酶温度耐受性不好，作用pH为中性偏碱性，仅有C.thermosulfurogenes来源的β-淀粉酶最适温度为70 ℃，最适pH为6.0，因此B.megaterium是β-淀粉酶来源的理想菌株。微生物来源的β-淀粉酶在以枯草芽孢杆菌作为宿主表达时，酶活水平受调控元件-启动子和碳分解代谢物阻遏效应（Carbon Catabolite Repression，CCR）的影响。启动子是提高外源蛋白表达水平的关键[16,17]，因此可通过筛选强启动子以及串联单启动子，获得活性较高的启动子；CCR效应是指枯草芽孢杆菌在混合碳源环境发酵时，优先利用速效碳源，且其产物会抑制其他非速效碳源代谢相关基因的表达[18,19]。CCR效应中起关键作用的是分解代谢物控制蛋白（Catabolite control protein A，CcpA），该蛋白在 DNA上的顺式调控元件称为分解代谢物响应元件（Catabolite Responsive Element，CRE），CRE是14 bp的回文序列且高度保守[20]。通过定点突变CRE位点保守碱基，可使细胞内阻遏复合物无法结合CRE位点，有效缓解CCR效应[21]，减弱对菌体生长和异源蛋白表达的抑制，从而提高β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的表达水平。

本研究从B.megaterium基因组中扩增β-淀粉酶基因，同时分析枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解链淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）转录组，选择扩增基因表达水平高的启动子，构建含有不同启动子的重组质粒，转化到宿主B.subtilisATCC 6051∆10中分泌表达，然后，通过基因编辑技术，定点突变CRE位点，提高β-淀粉酶的酶活水平，最后，将重组β-淀粉酶应用在糖化反应中，研究生成麦芽糖的转化率，为β-淀粉酶的高效表达提供强有力的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌Escherichia colistellar，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，巨大芽孢杆菌Bacillus megateriumDSM 319，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisATCC 6051∆10（SpoIIAC∆、srfC∆、aprE∆、nprB∆、nprE∆、mpr∆、vpr∆、bpf∆、epr∆、wprA∆），E.coli/ B.subtilispBE-穿梭载体，Amp+/Kan+，均为本实验室保存

1.1.2 试剂

Restriction Enzymes Fast Digest®购于赛默飞世尔科技公司；DreamTaq Green PCR Master Mix购于美国Thermo Fisher Scientific公司；Prime STAR® HS DNA Polymerase（premix）购于日本TaKaRa公司；HiFi DNA Assembly Cloning Kit试剂盒购于美国NEB公司；质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒均购于广州捷倍斯生物科技有限公司；引物于上海生工有限公司合成；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 培养基

LB培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠（固体含2%琼脂）。

SOC培养基：31.4 g SOC固体粉末溶于1000 mL水，116 ℃高温灭菌30 min。

LBS培养基：LB液体培养基，0.5 mol/L山梨醇。

发酵培养基：1.5%蛋白胨，3%酵母提取物，1%氯化钠，2%可溶性淀粉。

1.2 仪器

梯度PCR仪Veriti® 96-Well Thermal Cycler购于美国Applied Biosystems公司；移液枪、离心机、电转化仪购于德国Eppendorf公司；浸入式水平电泳系统购于美国 BIO-RAD公司；紫外可见分光光度计NanoDrop 1000购于美国Thermo Fisher Scientific公司；M200多功能酶标仪购于德国TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 单启动子表达质粒的构建、克隆及转化

1.3.1.1 pBE-AmyM表达质粒的构建及克隆

以B.megateriumDSM 319基因组为模板，设计特异性引物F-AmyM和R-AmyM（表1），由PCR反应扩增得到β-淀粉酶基因（基因的C末段含6×His标签序列，基因序列见附表1），产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和胶回收。用XhoI和XbaI酶切pBE质粒去除原有蛋白序列，胶回收载体片段，按照HiFi DNA Assembly Cloning Kit试剂盒说明书，将载体和β-淀粉酶基因片段连接，将连接液转化至E.colistellar感受态细胞，热击后加入SOC培养液复苏1 h，吸取适当复苏液涂抗性LB固体平板（含Amp），37 ℃恒温过夜培养，挑取阳性转化子，筛选验证正确后，送至测序公司测序，验证β-淀粉酶碱基序列。

表1 引物序列Table 1 List of primers

1.3.1.2 pBE-promoter-AmyM表达质粒的构建及克隆

以B.subtilis168基因组为模板，通过PCR扩增得到启动子 PB.S 168-aprE、PB.S 168-amy、PfusA、PgsiB、PyqfD、Ppgk、PsodA、PywzA、PgapA、Ptsf、PnprB、P43、PsrfA、Phag、Pveg、PydzA、PspovG片段，以B.licheniformis基因组为模板，通过PCR扩增得到启动子PB.liche-apr、PamyL片段，以B.amyloliquefaciens基因组为模板，通过PCR扩增得到启动子 PB.amy-apr、PamyQ、PsigW片段，产物经琼脂糖凝胶电泳和胶回收。用EcoRI和SpeI酶切pBE-AmyM质粒去除原有启动子序列，胶回收载体片段，分别连接启动子和载体片段，构建pBE-promoter-AmyM表达质粒（以pBE-PamyQ-AmyM为例），如图1所示，并按照1.3.1.1的方法转化至E.colistellar感受态细胞中，挑取阳性转化子，筛选验证正确后，送至测序公司测序，验证启动子序列。

图1 重组质粒pBE-PamyQ-AmyM的构建流程Fig.1 Construction of recombinant plasmid pBE-PamyQ-AmyM

1.3.1.3 pBE-promoter-AmyM 质粒电转进宿主Bacillus subtilisATCC 6051∆10

将测序正确的 pBE-promoter-AmyM 质粒电转至宿主中，电转化方法参照文献进行[22]，取10 uL质粒到B.subtilisATCC 6051∆10感受态细胞中电转，电转结束后立即加入890 μL的LBS培养液，37 ℃孵育2~3 h后，将复苏液涂布在抗性LB固体平板（含Kan），37 ℃恒温过夜培养，挑取阳性转化子并提质粒，进行琼脂糖凝胶电泳，验证质粒和酶切片段大小，得到构建成功的重组菌株 pBES01（PamyQ）、pBES02（PB.amy-apr）、pBES03（PamyL）、pBES04（PB.liche-apr）、pBES05（PB.S 168-amy）、pBES06（PB.S 168-aprE）、pBES07（PfusA）、pBES08（PgsiB）、pBES09（PyqfD）、pBES10（Ppgk）、pBES11（PsodA）、pBES12（PywzA）、pBES13（PgapA）、pBES14（Ptsf）、pBES15（PnprB）、pBES16（PsigW）、pBES17（P43）、pBES18（PsrfA）、pBES19（Phag）、pBES20（Pveg）、pBES21（PydzA）、pBES22（PspovG）。

1.3.2β-淀粉酶酶活力测定

参照文献[23]用3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）并做适当调整：取0.94 mL用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制的 1%可溶性淀粉作为反应底物（pH 6.0），于40 ℃预热5 min，加0.06 mL酶液，混合均匀，40 ℃保温15 min，取0.40 mL反应液加1.20 mL DNS试剂，沸水浴加热10 min，冷却至室温，取0.20 mL加去离子水0.80 mL，混合均匀后于540 nm波长测OD值。以标准麦芽糖溶液的不同浓度作为X轴，在540 nm波长下测得反应液的OD值为Y轴绘制标准曲线。一个酶活力单位（U）定义为：在pH 6.0、40 ℃条件下，每小时分解可溶性淀粉产生相当于1 mg麦芽糖所需的酶量。

1.3.3 单启动子对β-淀粉酶表达水平的影响

选择B.subtilisATCC 6051∆10作为对照菌株，将pBES01-pBES22等22株重组菌接种至含有3 mL（24孔板）LB液体培养基中作为种子液，37 ℃、220 r/min培养24 h，测定菌体浓度，按等生物量转接至含有3 mL（48孔板）发酵培养基中，37 ℃、220 r/min培养30 h，取发酵液于4 ℃、12000 r/min离心15 min，测定上清液中β-淀粉酶酶活，筛选出10株高表达菌株。将筛选的菌株和作为对照的B.subtilisATCC 6051∆10菌株，接种至含有50 mL（500 mL平底摇瓶）LB液体培养基中作为种子液，按照上述方法转接至含有100 mL（500 mL挡板摇瓶）发酵培养基中，37 ℃、220 r/min培养，从21 h开始每隔3 h取样，测定上清液中β-淀粉酶酶活和菌体生长量，筛选出高表达的单启动子重组菌株。

1.3.4 双启动子表达质粒的构建及对β-淀粉酶表达水平的影响

以筛选的单启动子重组菌株为模板，扩增启动子序列，构建含有双启动子表达质粒pBED01（P43-P43）、pBED02（P43-PamyQ）、pBED03（P43-PsigW）、pBED04（ P43-PspovG）、 pBED05（ P43-PgsiB）、 pBED06（P43-PB.liche-apr）、pBED07（P43-PnprB），电转化至宿主B.subtilisATCC 6051∆10中，摇瓶培养，测定上清液中β-淀粉酶酶活，筛选出高表达的双启动子重组菌株。

1.3.5 突变型 AmyM-CRE表达质粒的构建及对β-淀粉酶表达水平的影响

以菌株pBED01为模板，按照表2所示，设计碱基突变引物，扩增相应片段，PCR反应体系：质粒（浓度 100 ng/μL 左右）2 μL，上下游引物各 2 μL，2×Prime STAR 25 μL，ddH2O 补足到总体积为 50 μL。PCR 产物经验证大小正确后，胶回收目的片段并测定浓度。按照1.3.1.1方法，把带有突变位点的片段连接，将连接液转化至E.colistellar感受态细胞中，挑取阳性转化子进行验证和测序，将测序正确的转化子电转至宿主B.subtilisATCC 6051∆10中，以pBED01菌株作为对照，摇瓶培养，测定上清液中β-淀粉酶酶活。

表2 定点突变CRE位点的不同碱基Table 2 Site-directed mutation of different bases at CRE site

1.3.6 重组β-淀粉酶的纯化和Western blot鉴定

重组β-淀粉酶纯化采用镍柱亲和层析法[24]。重组β-淀粉酶带有His标签与层析柱上的Ni2+发生螯合反应而被吸附，从而得到纯度较高的蛋白酶液。发酵上清液在4 ℃，12000 r/min离心15 min后，用0.22 μm滤膜过滤，使用GE公司的5 mL HisTrap TMHP层析柱，采用10%梯度洗脱柱子，流速1.0 mL/min，收集有峰的洗脱液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测纯化效果，并进行Western blot特异性鉴定。

1.3.7 重组β-淀粉酶在糖化反应过程中的应用

将一定质量的麦芽糊精烘干至恒重后，称取30 g溶于100 mL去离子水中，配置30%（W/V）的麦芽糊精溶液，为提高麦芽糖转化率，使酶在最适条件下反应，故调节麦芽糊精溶液pH为6.0，放入50 ℃恒温水浴摇床中预热后，分别加入重组β-淀粉酶50、100、200、400 U/g（干麦芽糊精），将反应液倒入500 mL摇瓶中，置于50 ℃水浴摇床，转速设定为100 r/min，反应48 h后，煮沸样品终止反应，按1:1比例加入色谱纯乙腈，静置沉淀2 h后，取上清液8000 r/min离心20 min，0.22 μm微孔膜过滤，通过HPLC检测反应产生麦芽糖的量，根据标准曲线计算麦芽糖转化率。

色谱条件：色谱仪为 Waters 2695-2414，检测器为示差检测器，色谱柱为Aminex HPX-87H (Bio-Rad)，柱温为60 ℃，流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min。

2 结果与讨论

2.1β-淀粉酶基因克隆及序列分析

通过PCR扩增得到β-淀粉酶基因全长1656 bp，共编码551个氨基酸，其中有6个组氨酸和一个终止密码子（β-淀粉酶基因序列见附件1），经SignalP 4.1在线预测分析，表明该蛋白具有 N-端信号肽，其中1~20位为信号肽序列，β-淀粉酶分子量约为58 ku。经比对β-淀粉酶基因编码区存在 CRE位点：TGTTAACGCTTTCA，和高保守序列完全一致。

2.2 不同单启动子高效表达菌株的筛选

用XhoI和XbaI酶切得到pBE载体片段（图2），大小为7351 bp，琼脂糖凝胶电泳验证载体片段大小与预期一致，经PCR扩增得到单启动子片段（图2，以PsigW启动子为例，其余启动子电泳图见附件2，启动子序列见附件 3），最后经测序验证 pBE-Promoter-AmyM质粒构建正确。

图2 pBE-AmyM载体片段与PCR扩增片段电泳图Fig.2 Electropherogram of pBE-AmyM and PCR products

将构建成功的大肠杆菌菌株提质粒，电转至宿主B.subtilisATCC 6051∆10，接种发酵培养基培养30 h后，测定上清液中β-淀粉酶酶活（图3），可看出不同启动子介导β-淀粉酶酶活差异较大，其中 pBES01（PamyQ）、pBES03（PamyL）、pBES04（PB.liche-apr）、pBES08（PgsiB）、pBES15（PnprB）、pBES16（PsigW）、pBES17（P43）、pBES18（PsrfA）、pBES19（Phag）、pBES22（PspovG）菌株上清液中β-淀粉酶酶活高于其他启动子。

图3 不同单启动子重组菌株酶活水平Fig.3 Enzyme activity levels of recombinant strains with single promoter

选取10株高表达菌株摇瓶培养，测定上清液中β-淀粉酶酶活（图4a）和菌体生长量（图4b），研究发现大部分菌株从24 h开始进入稳定期，酶活水平大多在27 h时达到最高，其中由P43介导的菌株β-淀粉酶酶活可达到1165.82 U/mL，为单启动子介导表达的最高水平，随着时间的延长酶活降低较快，这可能和σ因子有关，它是RNA聚合酶识别启动子序列的关键因子，启动子活力通过σ因子与生长时期相关联，B.subtilis168来源的胞苷脱氨酶启动子P43，是由σA和σB分别识别两个重叠的-10区和-35区，启动强度对于多数目的蛋白较强，但其σ因子调控基因表达时期为对数生长中期和稳定期，因此在稳定前期 P43启动子介导的β-淀粉酶酶活最高，随着菌体生长到稳定后期，则不再有转录活性，酶活表达水平开始降低[25]。

图4 单启动子重组菌株酶活水平以及菌体生长量Fig.4 Enzyme activity expression levels of recombinant strains with single promoter and bacterial growth

2.3 不同双启动子高效表达菌株的筛选

对重组菌株 pBE-P43-promoter-AmyM 分别在 27 h、30 h和33 h取上清液，测定β-淀粉酶酶活，通过比较发现：菌株 pBED01（P43-P43）酶活水平高于其他菌株（图5a）；菌株pBED03（P43-PsigW）酶活水平在30 h达到最高，之后开始降低（图5b），说明两个启动子串联表达时，会延长蛋白酶表达的时间；双启动子介导β-淀粉酶酶活水平明显高于单启动子，但并无明显规律，这可能和启动子的性质以及目的蛋白有关系，不同的目的蛋白对启动子有一定的匹配度。

图5 双启动子重组菌株在27 h的酶活水平和在不同时间的酶活水平对比Fig.5 The enzyme activity level of recombinant strains with different dual-promoters at 27 h and the comparison of expression levels at different times

2.4 突变型AmyM-CRE表达菌株的筛选

定点突变CRE位点碱基，获得五株突变菌株，摇瓶培养，测定上清液中β-淀粉酶酶活（图6）。由pBE01和pBE02可知，当只突变不同位点的一个碱基时，两株菌表达β-淀粉酶酶活水平相当，由pBE03可知，当突变两个碱基位点时，β-淀粉酶酶活得到了进一步提升，但当突变三个和四个碱基之后，pBE03、pBE04和pBE05菌株β-淀粉酶酶活水平基本无变化，这可能是定点突变两个高保守的CRE位点后，细胞内阻遏复合物已不能与CRE位点结合，因此CCR效应已在最大程度上得到缓解，β-淀粉酶酶活水平相较未突变前提高58.03%。

图6 突变型菌株在27 h的酶活水平Fig.6 The expression level of enzyme activity of mutant strains at 27 h

2.5 重组β-淀粉酶纯化和Western blot鉴定

对带有His标签的重组β-淀粉酶发酵上清液处理后，进行镍柱亲和层析纯化（图7a），并进行SDS-PAGE蛋白电泳（图7b），结果显示存在单一的目的条带，经Western blot特异性鉴定（图7c），结果显示为一条特异性免疫反应条带，证明确为表达的目的蛋白β-淀粉酶。

图7 重组β-淀粉酶纯化图谱、纯化后的重组β-淀粉酶SDS-PAGE分析、Western blot特异性鉴定Fig.7 The process of purification of recombinant β-amylase、SDS-PAGE analysis and Western blot specific identification

2.6 重组β-淀粉酶在糖化过程中的应用效果

2.6.1 标准曲线的绘制

用麦芽糖标品配置浓度为 0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL的标准溶液，按照1.3.6的实验方法，测定标准麦芽糖溶液的峰图（图8a），由色谱图看出，麦芽糖出峰时间为7.08 min，色谱图中无干扰峰，峰图形状标准，可用于定量分析样品中麦芽糖含量，由标准曲线可看出（图8b），麦芽糖标准曲线的线性方程为 y=69484x-796.72，R2=0.9998，线性关系较好。

图8 麦芽糖标品出峰图和标准曲线Fig.8 Peak diagram of maltose standard product and standard curve

2.6.2 重组β-淀粉酶不同加入量对麦芽糖转化率的影响

随着重组β-淀粉酶加入量的增加，麦芽糖转化率在一定范围内呈升高趋势，当加酶量达到200 U/g时，麦芽糖转化率达到最高水平为57.62%，而当加酶量继续增大时，麦芽糖转化率则不再继续提高，这可能是底物麦芽糊精已经消耗完全（图9）。

图9 样品色谱图和重组β-淀粉酶不同加入量对麦芽糖转化率的影响Fig.9 Chromatogram and the effect of different amounts of β-amylase on maltose conversion rate

3 结论

3.1 枯草芽孢杆菌作为宿主菌表达异源蛋白，技术比较成熟，菌株生长特性强，蛋白分泌背景清晰，并且其独特的内源性代谢模式，提高了蛋白分泌加工效率，不产生包涵体，表达的蛋白直接分泌在胞外培养基中，简化蛋白下游加工分离纯化程序，本实验采用的宿主B.subtilisATCC 6051∆10是通过温敏型质粒pKS无痕敲除体系，对野生菌的10个基因进行敲除，敲除的基因对菌株生长无影响，但有利于维持异源蛋白表达的稳定性，提高表达水平，并且在发酵过程中起泡较少[26]，因此本实验选择B.subtilisATCC 6051∆10作为发酵菌株。随着生物信息学的发展，芽孢杆菌的启动子在转录组水平上得到了深入的研究，利用转录组分析技术可以高通量筛选表达水平高的强启动子，Martin等[27]研究也证实了启动子与其调控的基因水平间呈正相关，因此本实验选择转录组中高表达基因的启动子，构建重组菌株，调控β-淀粉酶表达水平。

3.2 本实验分别构建了22株单启动子和7株双启动子介导β-淀粉酶表达的菌株，其中双启动子P43-P43介导的重组菌株在摇瓶培养27 h时，β-淀粉酶酶活水平达到2950.76 U/mL，是单启动子介导表达的2.53倍，通过碱基突变，有效缓解碳代谢阻遏效应，重组β-淀粉酶酶活水平最高可达到4663.03 U/mL，为β-淀粉酶工业化生产提供了理论支持。

3.3 对重组β-淀粉酶进行镍柱亲和层析纯化和Western blot特异性鉴定，结果为单一目的条带，证明β-淀粉酶表达成功，同时将重组β-淀粉酶应用于糖化反应中，得到麦芽糖转化率为57.62%。综上，本研究为重组β-淀粉酶的工业化生产提供了理论依据，后续可以进一步研究发酵条件的优化，以得到更高表达的酶活水平。