肌萎缩侧索硬化SOD1基因多态性与临床表型分析☆

吴瑞鹏 冯斌 任占宏 谷成高福林 张毅

肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis muscular atrophy，ALS） 分为家族性 ALS （familial amyotrophiclateral sclerosis，FALS）和散发性 ALS（sporadic amyotrophic lateral sclerosis，SALS）。关于ALS的基因组学特征，现阶段研究较明确的有铜/锌超氧化物歧化酶1（Cu/Zn superoxide dismutase，SOD1）、 反式激活反应-DNA结合蛋白 （TARDBP）基因、C9orf72基因、肉瘤熔合（FUS）基因，占到家族性 ALS的20%，占到散发型ALS的1%[1-2]。与SOD1基因相关的亚型称为ALS1亚型，目前SOD1基因已经报告了200余种基因突变类型[3]，中国ALS人群中的研究共报告了SOD1基因突变26种[4-8]，国内报告较多的SOD1基因突变H46R 、V47A、G37R、Cys111Tyr和 Gly147Asp，多集中于华北地区及华东地区[9]。甘肃为亚高原，多民族杂居，ALS基因组学有其特征性表现，本研究收集甘肃地区FALS患者家系进行SOD1基因突变检测，分析SOD1突变患者的临床特点及突变与临床表型关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象纳入2018年1月至2020年6月收治的18例FALS家系的先证者，男7例，女11例，平均年龄（48.3±12.6）岁。所有病例由至少两位以上神经内科专科医生独立做出诊断，诊断标准依据EI Escorial修订诊断标准[10]。排除标准：①有肿瘤疾病史；②有严重心脑血管疾病；③精神异常及外伤病史；④有其他家族遗传病史。所有研究对象签署知情同意书，本研究得到我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 抽取先证者外周血2 mL，酸性柠檬酸葡萄糖溶液（ACD）抗凝后，用 Qiagen试剂盒进行DNA提取，无水乙醇洗涤两次，-80℃保存。

1.2.2 SOD1基因PCR扩增引物及反应条件

表1 SOD1基因PCR扩增引物及反应条件

1.2.3 DNA序列分析 PCR产物Qiaquick柱纯化，采用美国ABI公司生产的3730 DNA自动测序仪进行 DNA序列分析，测序结果与美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中心公布的人类基因组SOD1 cDNA序列进行比对。

2 结果

18例先证者中，3例检测出SOD1阳性，均为杂合突变，其中 2例 p.Gly73Ser突变，1例p.G42D突变，其余15例未检测出SOD1基因突变，SOD1基因阳性突变检出率为 16.67%（3/18例）。

2.1 先证者SOD1基因突变的家系分析p.Gly73Ser突变FALS家系临床资料如下。A（图 1A）：先证者（Ⅲ6）为 46岁女性，以缓慢进展的右上肢无力为首发症状，患者于2017年8月发现右手拇指和食指捏握无力，数月后出现部位不固定的肌束颤动，无疼痛及其他不适感觉，2018年3月，发现右上肢肌肉萎缩，以大鱼际肌及三角肌萎缩明显。期间就诊多家医院，于2019年7月在我院就诊，患者出现左手力弱，伴行走时右足活动不灵活，伴有活动后气短，查体发现右手及上臂肌肉无力、萎缩，锥体束症状不明显。肌电图提示脊髓颈段、胸段神经源性损害。先证者两子目前无发病，先证者叔叔（Ⅱ2）于57岁时因呼吸衰竭过世，于45岁时开始出现腿部无力，病情缓慢进展，9年后开始使用轮椅，期间就诊多家医院诊断ALS，发病10余年后因呼吸衰竭行气管切开辅助呼吸机通气，半年后过世。先证者父亲（Ⅱ4）于63岁时死于结肠癌并脑转移，当时结肠癌确诊5年，已行手术切除，期间无运动神经元病的表现。先证者母亲（Ⅱ5）现已 76岁，目前身体健康。B（图 1B）先证者（Ⅲ3）为50岁女性，4年前发现双手持物困难，左侧重，1年多后出现走路不稳，上下楼梯困难，后逐渐出现左上肢鱼际肌、前臂肉跳，无球部症状，肌电图提示广泛神经源性损害（脊髓颈胸腰段），全脊髓MR无异常。先证者母亲（Ⅱ2）病史7年，后因继发肺部感染过世。先证者叔叔47岁死于车祸伤。

图1 p.Gly73Ser突变的FALS家系图（A、B图）

p.42GD突变FALS家系临床资料如下。先证者 （Ⅳ1）为45岁女性，病史8年，她在37岁时出现走路摇晃、不稳，之后的4年多病情缓慢进展，42岁时出现双腿僵硬感，自觉右腿比左腿严重，43岁时需手杖行走，44岁时行走需要轮椅，同时出现上肢肌无力伴随吞咽困难，半年后出现声音嘶哑、呼吸急促，伴弓形足及肌束震颤，全脊髓MR、血液、脑脊液检查均无异常。肌电图显示神经源性改变。先证者母亲（Ⅲ1）健康，父亲（Ⅲ2）因30多年的单侧下肢肌萎缩，一直未明确诊断，其基因型为p.G42D杂合突变。家族史中的一位叔叔（Ⅲ3）于70岁时死于散发ALS。其弟（Ⅳ3）发育迟缓，其小姨（Ⅲ10）和表弟（Ⅳ4）诊断为遗传性痉挛性截瘫（图2）。

图2 p.G42D突变的FALS家系图

2.2 SOD1基因突变结果

图3 对先证者应用NGS+PCR-Sanger测序法对SOD1基因5个外显子和侧翼序列的突变筛查发现，突变位于3号外显子的杂合突变，cDNA在217位碱基由G突变为A，使第73位氨基酸由甘氨酸变为丝氨酸，如图3。

图3 SOD1基因外显子3的 p.Gly73Ser（c.217G＞A）杂合变异

图4 对先证者应用NGS+Sanger测序法对SOD1基因5个外显子和侧翼序列的突变筛查发现，突变位于2号外显子的杂合突变，cDNA在125位碱基由G突变为A，使第42位氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸，如图4：p.G42D（c.125G＞A）。

图4 SOD1基因外显子2的 p.G42D（c.125G＞A）杂合变异

3 讨论

ALS是一种累及上下运动神经元的慢性退行性疾病，临床表现肌肉无力萎缩，椎体束征等，疾病后期出现严重的肌肉萎缩、延髓麻痹，最终多因呼吸衰竭或继发肺部感染死亡。目前病因、病理机制仍不明确，针对病因的研究多集中在兴奋性氨基酸毒性、自由基蓄积、遗传机制等，遗传机制目前得到广泛认可。在ALS中约有10%FALS，大多数FALS为常染色体显性遗传，目前已有30多个基因与FALS相关，SOD1的突变率国外报告仅有20%[11]，本研究中18例先证者中，SOD1阳性概率仅为16.67%，与陈嬿等[6]报告的23.06%、张华纲等[7]报告的23.3%较低，提示SOD1基因在甘肃地区FASL患者中阳性率偏低。本研究中共收集FALS患者18例，汉族占15例，回族占1例，东乡族 1例，藏族1例，仍以汉族为主要发病群体，少数民族占16.67%，汉族仍是FALS发病的主要群体。SOD1基因蛋白是一种自由基清除酶，在神经组织、红细胞及肝脏中呈现高表达，具有抗氧化作用。目前认为SOD1基因突变导致蛋白毒性功能的获得是SOD1基因的致病机制[8]，种族差异对SOD基因突变的影响目前国内尚无文献报告。我们猜测甘肃地区虽为亚高原地区，多民族杂居，除饮食结构有差异外，环境、物理因素、生活习惯均被汉化，因此种族差异对基因影响较小。

本研究中p.Gly73Ser突变的临床表型：先证者以肢体无力起病，以下运动神经元损害为主，病情进展缓慢，最终导致呼吸衰竭，病史达10年之久。ORRELL等[12]在一个ALS家系中检出 SOD1基因 Gly72Ser（同 p.Gly73Ser）杂合突变，红细胞检测结果显示SOD1酶活性降低45%，SHAW等[13]在1例ALS患者中检出SOD1基因Gly72Ser突变，此患者以下肢痉挛无力起病，最终呼吸衰竭，病程2年。这一类型临床表现以下肢起病，上运动神经元损害不明显，易误诊为周围神经病变，且目前国内尚无此突变基因的报告。p.G42D突变发病年龄较小，30多岁起病，病情进展缓慢甚至处于相对静止状态，以下肢起病为主，病史长达30年。由于先证者父系和母系可能存在交叉影响，导致先证者弟弟幼年时期出现智力低下，具体基因型尚不明。

目前在人类基因库中报告了200多个SOD1基因突变，其临床表现多样化，从急性进展性到缓慢演变，其进展方式也各有不同[14]。本研究对甘肃地区18个FALS家系筛查SOD1基因突变，检出Gly72Ser和p.G42D两种突变，这一结果扩大了中国FALS患者的SOD1基因突变谱。同时通过对SOD1基因突变与临床表型关系的探讨，为更准确诊断FALS及判断预后提供依据，也为ALS患者及其亲属提供基因学的遗传咨询。