金银花叶总黄酮不同提取方法比较及其抗氧化活性研究

田存章，贺新平，曹乐乐，谢一鸣，姬国杰，万嘉欣

（1.新乡医学院三全学院生物与基础医学实验教学中心，河南新乡 453003；2.新乡医学院三全学院生命科学技术学院，河南新乡 453003）

金银花（Lonicera japonica Thunb.）作为我国常见中药材，具有抗菌消炎、清热解毒、保肝利胆等功效[1]，主要种植于山东、河南、广东等地。金银花叶作为金银花的附属产物，产量高且采集便利，却一直未被充分合理利用。研究资料表明，金银花叶中富含多种黄酮类化合物，具有抑菌、抗氧化、抗病毒等多种生物药理活性作用，在食品、药品、化妆品和保健品行业具有潜在的开发应用前景[2-4]。当前，植物天然生物活性成分药理作用研究越来越受到重视[5]，本研究旨在探究金银花叶总黄酮的最佳提取方法及其抗氧化能力，以期为金银花资源的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

金银花叶采集于河南省封丘县。

1.2 试剂与仪器

芦丁对照品（批号100080-201811），中国食品药品检定研究院；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）-二铵盐（ABTS），Macklin 公司；无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司。

T6 新世纪紫外可见光光度计，宁波欧普仪器有限公司；101 型号电热鼓风干燥箱，上海科恒实业发展有限公司；R-206D 旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；MS105 电子分析天平，梅特勒公司。

1.3 金银花叶总黄酮的提取

1.3.1 回流提取法

称取金银花叶粉末2.0 g 至150 mL 烧瓶中，按1 ∶20（g ∶mL）的料液比加70%乙醇溶液，加热回流提取3 次，每次2 h，过滤，合并过滤液。

1.3.2 索氏提取法

称取金银花叶粉末2.0 g，用滤纸包好放入抽提筒中，按1 ∶20（g ∶mL）的料液比加70%乙醇溶液，加热索氏提取3 次，每次2 h，合并过滤液。

1.3.3 超声辅助浸提法

称取金银花叶粉末2.0 g，按1 ∶20（g ∶mL）的料液比加70%乙醇溶液，50 ℃条件下，超声功率250 W、提取温度50℃、超声时间40 min，提取3 次，过滤，合并过滤液。

1.4 金银花叶总黄酮样品制备

将金银花叶黄酮提取液进行减压浓缩蒸干后，用蒸馏水悬浮，等体积石油醚洗涤3 次，乙酸乙酯萃取3 次，回收乙酸乙酯部分，进行减压浓缩干燥，再用少量无水乙醇溶解并定容至50 mL，4 ℃保存，备用。

1.5 总黄酮含量测定

1.5.1 标准曲线绘制

精确配制0.20 mg/mL 的芦丁对照品溶液，分别 取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 和3.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 法[6]在510 nm 处测定不同浓度芦丁对照品溶液的吸光度A510。以芦丁浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A510为纵坐标绘制标准曲线。

1.5.2 精密度实验

精密量取6 份芦丁对照品溶液0.5 mL，按“1.5.1”项下测定方法，在波长510 nm 处分别测定其吸光度A510，计算RSD值。

1.5.3 稳定性实验

分别量取“1.4”项下回流提取法得到的金银花叶供试品溶液1.0 mL，于室温条件下放置0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min 后，按照“1.5.1”项下测定方法，在波长510 nm 处分别测定其吸光度A510，计算RSD值。

1.5.4 重复性试验

分别量取6 份“1.4”项下回流提取法得到的金银花叶供试品溶液1.0 mL，按照“1.5.1”项下方法，在波长510 nm 处分别测定其吸光度A510，计算RSD值。

1.5.5 加样回收实验

分别量取6 份“1.4”项下回流提取法得到的金银花叶供试品溶液0.5 mL，再加入对照品溶液0.5 mL，按照“1.5.1”项下方法，在波长510 nm 处分别测定其吸光度A510，计算RSD值。

1.5.6 金银花叶总黄酮含量测定

精密取金银花叶供试品溶液各1.0 mL，置于10 mL 容量瓶中，按照“1.5.1”项下方法测定吸光度，计算供试样品中总黄酮含量。

1.6 金银花叶总黄酮抗氧化活性测定

1.6.1 供试品及对照品维生素C 溶液配制

将“1.4”项下制备的金银花叶供试品溶液和对照品维生素C 溶液分别配制成质量浓度为2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、6.0 μg/mL、8.0 μg/mL、10.0 μg/mL、12.0 μg/mL、14.0 μg/mL、18.0 μg/mL、22.0 μg/mL、26.0 μg/mL、30.0 μg/mL、34.0 μg/mL、40.0 μg/mL、45.0 μg/mL、50.0 μg/mL、60.0 μg/mL、80.0 μg/mL的系列溶液，备用。

1.6.2 ABTS 样品溶液配制

配制7 mmol/L 的ABTS 溶液与等体积的2.457 mmol/L过硫酸钾混合，室温避光反应16 h，得到ABTS 储备液，备用。

1.6.3 金银花叶总黄酮对ABTS 自由基的清除能力测定

ABTS 自由基清除率测定参考鲍素华、李艳荣[7-8]的方法并部分修改，取ABTS 储备液用10 mmol/L PBS 缓冲液稀释，使其在波长734 nm 下的吸光值为0.70±0.02。

分别取0.3 mL 不同质量浓度的供试品溶液和4.0 mL ABTS 工作液，混匀，室温避光反应10 min，在波长734 nm 处测定各样品溶液吸光为A1；用PBS 缓冲液代替ABTS 工作液，测定其吸光度为A0；用乙醇代替供试品溶液测定吸光度A2。根据公式（1）计算清除率。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以芦丁为对照品，得到标准曲线方程为y=0.013 5x-0.001 7，r2=0.999 9，其 在10 ～60 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.2 精密度、稳定性及重复性试验

取芦丁对照品溶液或供试品分别进行精密度、稳定性及重复性试验，其RSD值分别为1.09%、1.01%、0.40%（n=6），表明该试验精密度、稳定性及重复性均良好。

2.3 加样回收率试验

对供试品溶液进行加样回收试验，计算其平均加样回收率为97.91%，RSD值为1.24%，表明该试验加样回收率结果良好。

2.4 金银花叶总黄酮含量测定

3 种提取方法得到的供试品总黄酮含量测定结果见表1。由表1 可知，回流提取、索氏提取和超声辅助浸提法所得总黄酮含量分别为（4.87±0.02）mg/g、（3.83±0.03）mg/g、（2.85±0.02）mg/g（n=6），其中回流提取法所得的供试品中总黄酮含量最高。

表1 不同提取方法金银花叶总黄酮测定结果 单位：mg/g

2.5 金银花叶总黄酮对ABTS 自由基的清除能力测定

不同质量浓度的金银花叶总黄酮和对照品维生素C 对ABTS 自由基的清除率结果见图1。如图1 所示，在0 ～45.0 μg/mL 范围内，金银花叶总黄酮对ABTS 自由基的清除率随黄酮浓度的升高而增强，当总黄酮浓度为45.0 μg/mL 时，其清除率为92.21%，总黄酮浓度继续增加，清除率趋于平衡。金银花叶总黄酮和对照品维生素C 的IC50分别为17.015 μg/mL、25.072 μg/mL，表明金银花叶总黄酮清除ABTS 自由基的能力强于维生素C。

图1 金银花叶总黄酮和维生素C 对ABTS 自由基的清除能力

3 结论

对芦丁对照品或供试品溶液进行精密度、稳定性、重复性试验及加样回收试验，结果表明其精密度、稳定性、重复性及加样回收试验结果均良好。回流提取、索氏提取和超声辅助浸提法3 种提取方法所得供试品总黄酮含量分别为（4.87±0.02）mg/g、（3.83±0.03）mg/g、（2.85±0.02）mg/g，其中乙醇回流提取法对金银花叶总黄酮的提取效率最高。在0 ～45.0 μg/mL 范围内，金银花叶总黄酮和维生素C 对ABTS 自由基的清除率随浓度的升高而增强，且金银花叶总黄酮清除ABTS 自由基的能力优于维生素C。