水环境中抗生素的抑菌性检测手段探讨

陈汝琬

福州市规划设计研究院集团有限公司

1 引言

自1929年A.Fleming发现青霉素以来，全世界已经生产并使用了多种抗生素来治疗由病原菌引起的人类、动物和植物的疾病。因此，大量抗生素通过家庭、医院、制药公司、污水处理厂以及水产养殖和牲畜养殖场的排放物释放到环境中。当前，抗生素几乎在世界所有地方的地表水、地下水、土壤、沉积物和生物群中以较高浓度存在，所以抗生素已经被列为一种新兴的污染物类别[1]。水环境中存在多种抗生素会对水生生物造成生态风险，并导致水生生态系统中抗生素抗性基因（ARGs）和抗生素抗性细菌（ARB）的生成[2]。这种情况引起了人们对水生环境中抗生素残留的严重关注，尽管我国对抗生素药物的使用进行了严格的规定，但是抗生素的使用量和应用率依旧居高不下，造成了抗生素超量使用，甚至滥用，由此带来了严重的环境污染问题，细菌耐药性问题也日益突出[3]。抗生素由于分子量较大、种类繁多且普遍具有生物毒性，在污水处理过程中无法被完全去除，导致经常规污水处理技术处理后的出水可能具有抑菌性。所以，在抗生素流入浓度较高的污水厂进行出水的抑菌测试很有必要。本文综述了水环境中抗生素污染现状以及实验室常用的几种抑菌试验方法。

2 抗生素污染现状

抗生素是由微生物（包括细菌，真菌，放线菌）或更高等的动植物在其整个生命中产生的次要物质，具有抗病原体或其他活性，并且可能会干扰其他活细胞的发育的化学物质。根据药理特性，抗生素可以分为氨基糖苷类，β-内酰胺类，糖肽类，大环内酯类，喹诺酮类，磺酰胺类和四环素类[4]。近年来，抗生素广泛用于预防和治疗人类和动物的细菌感染，全球范围内的抗生素使用提高了传染病的治疗率和农业生产率。但是，抗生素的使用规模和范围越来越广泛，其造成的污染对水生环境和陆地生态系统的威胁也越来越严重。人类和动物消耗和排泄后，各种形式的抗生素将释放到环境中，如图1所示。据估计，2013年我国向环境中排放了约53800吨抗生素，这主要来自水产养殖和畜牧农场的废水以及未经充分处理的污水。近年来，在污水处理厂、河流、湖泊、海洋、地下水、沉积物甚至饮用水中均会检测到各种抗生素[5]。2005年至2016年期间，在我国的水样中共监测到超过90种抗生素，浓度范围为0.1ng/L~1000ng/L。从地域上来看，在华北和华东地区的河流和湖泊中抗生素检测浓度较高，这与华北和华东地区的人口规模和抗生素使用量情况相一致[1]。

图1 抗生素进入水环境途径

环境中抗生素的残留非常有利于ARB和ARGs的发展和传播，从而导致了抗生素抗性病原体的增加，会对生态系统产生严重影响。同时，世界卫生组织认为能够引起感染的ARB也对人类健康有着巨大的潜在威胁。随着抗生素的广泛应用，含抗生素废水大量流入污水处理厂。由于细菌密度高、营养丰富、污染物种类多（包括抗生素、杀菌剂、药物和重金属等），城市污水为ARB的繁殖提供了适宜的条件。此外，污水处理厂中还存在与人类共生和环境相关的微生物群，促进了ARGs的共享，甚至引入了对致病微生物的新抗性机制[6]。因此，在污水处理厂出水指标检测时进行抑菌性试验，对出水进行抑菌性测试非常有必要。

3 抑菌试验

抑菌试验是用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验，各种抑菌试验广泛应用于新开发的防腐剂、抗菌剂、植物精油以及药物等多个领域。液体培养基法、固体培养基法和高通量筛选法是三种常见的体外抑菌试验方法[7]。

3.1 液体培养基法

液体培养基法是将液体营养培养基用于细菌培养的一种方法，常用方法包括浊度法、微肉汤稀释法和营养物消耗法。这种方法相对易于操作，结果直观易观察，适用于高溶解度药物的检测。在环境领域中，测试处理后水体的抑菌性会用到比浊法，将抑菌效果转移至吸光度，可以通过吸光度的改变判断抑菌性的高低。Snowberger等人利用比浊法进行抑菌实验，以大肠杆菌为基础，发现环丙沙星、沙拉沙星和诺氟沙星这三种产品抗生素的抑菌效力与母体氟喹诺酮类药物的抑菌效力相当或更高，这些结果强调了在紫外降解抗生素过程中要考虑抗生素中间转化的重要性[8]。

3.2 固体培养基法

固体培养基法是将琼脂培养基用于细菌培养的一种方法，一般的方法包括扩散法、菌落计数法和药敏平板法。此类方法具有很高的准确性，可重复性，易于操作且成本较低[9]。在环境水样测试中，扩散法最常用于测试抗菌性能。这是因为扩散耗材简单易用，并且结果明显可区分。扩散法主要包括纸扩散法、牛津杯法和打孔法。纸扩散法（也称为K-B法）通常包括对圆形滤纸进行灭菌和干燥，将灭菌的滤纸浸入待测抗菌溶液中，然后将其置于测试板上进行培养。具体的操作方法如下：将无菌滤纸放在待测溶液的无菌培养皿中，在整个无菌操作过程中取出药纸，擦去多余的溶液并将其黏在固体表面上。轻轻按压滤纸，使滤纸与培养基紧密接触。通过将培养皿在37°C的恒温培养箱中放置24小时并观察药纸周围的抑菌区域的大小来确定溶液的抑菌性。

牛津杯法是使用牛津杯进行扩散试验的方法，将一定量的待测试抗菌溶液注入牛津杯中，进行培养和观察。具体的操作方法如下：将无菌牛津杯放在酒精灯的火焰上，快速加热以对其进行消毒，然后将牛津杯垂直于培养基表面放置，然后轻轻按压以确保杯底与培养基无缝贴合。将相同量的待测溶液注入每个牛津杯中。对于对照试验，可以添加相同量的盐水，并在37°C培养24小时，通过观察牛津杯周围抑制区的大小反应溶液的抗菌性。

打孔法是用灭菌后的钢管在试验平板上打孔，挑去培养基小块以做成圆孔，向孔中注入一定量的待测抑菌溶液后进行培养观察。具体操作方法为：在制备好的固体平板上，利用灭菌后的打孔器垂直打出大小完全相同的几个小孔，保证孔的分布均匀，与培养皿边界保持15mm以上距离。用灭菌牙签将琼脂块挑出。在每个孔注入等量待测溶液，37°C培养24小时，通过观察孔周围抑菌圈的大小来判断出水的抑菌性[10]。

K-B和牛津杯方法的误差相比于打孔法要高很多，这是由于K-B和牛津杯方法从介质表面向外围呈球形扩散（见图2），扩散程度与培养基厚度直接相关。介质越厚，表面和底部的扩散率差异越大，表面和底部抑制区的直径相差越大。而打孔法中待测溶液在培养基周围均匀分布（见图2），从而使培养基表面和底部的抑制区域大小相等，并避免了测量误差[11]。Geng等人利用了打孔法检测了利用真空紫外/紫外降解喹诺酮类抗生素中间产物的抑菌能力，实验结果表明利用真空紫外/紫外工艺中间产物的抗菌活性会低于紫外工艺的抗菌活性[12]。

图2 不同扩散方法的渗透方式

3.3 高通量筛选法

高通量筛选是一种快速鉴定细菌和药物敏感性的检测方法。这种方法操作简便，检测过程周期短，分析准确，可以高通量检测和筛选，并且克服了传统抗菌活性筛选过程耗时长的问题，减小了劳动强度和材料消耗，是目前研究药物对细菌敏感性流行的检测方法[7]。但高通量仪器耗材昂贵、成本高，并不适用于环境领域中应用到的低精度的抑菌实验。

3.4 定性与定量试验

根据抑菌试验测试需求的不同，抑菌试验可以分为定性试验和定量试验两种形式。定性试验常用琼脂扩散法，包括以上介绍的滤纸片法、平板打孔法、牛津杯法等，试验精度较低。定量试验常用最小抑菌浓度测定试验，针对不溶性抑菌物采用琼脂梯度稀释法，针对可溶性抑菌物采用营养肉汤梯度稀释法。定量试验时需要取若干个试管，分别编号，将目标菌种浓度进行梯度稀释，37℃培养24h后，观察比较每个试管中培养液浑浊度。无菌落长出的试管中培养液澄清，有菌落长出的试管中培养液浑浊。产生浑浊液的最低浓度则为最小抑菌浓度，稀释梯度越密集测试精度越准确[10]。

4 结束语

现如今，抗生素对水环境污染严重，污水厂长期滞留在其中不仅抑制活性污泥的生物活性，还会产生高排放污染物。在废水和活性污泥中经常检测到ARB，这些类型的ARB如果成为生活污水中的优势菌群，会导致横向基因转移，入侵到人和动物中，诱导形成严重的耐药性，使抗生素对人和动物致病菌治疗能力大大降低。本文综述了水体中抗生素污染现状和抑菌试验的几种试验方法，这些抑菌试验操作方式简单，试验原料易取得，适用于对于精度要求不高的水处理试验，对污水处理厂出水增设抑菌性测试可以减少含抗生素废水对环境和生态的进一步影响。