2012年度侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)侵袭性酵母菌感染的分布特征

段思蒙 肖盟 黄晶晶 王贺, 张戈 张京家 康巍 王瞳 肖玉玲 倪芳 高岚美 叶丽艳 郭鹏豪 万喆 陈中举 杨青 林洁 胡庆丰1 李虹玲1 岳娜1 崔兰英1 李刚1 范会1 苏丹虹1 刘丽文 田素飞 赵声远 杜雪飞2 周宏伟2 徐英春

[1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科，北京 100730；2.“侵袭性真菌病机制研究与精准诊断”北京市重点实验室，北京 100730；3. 丹娜(天津)生物科技有限公司，天津 300451；4. 四川大学华西医院，成都 610041；5. 江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院)，南京 210029；6. 福建医科大学附属协和医院，福州 350001；7. 解放军总医院，北京 100036； 8. 中山大学附属第一医院，广州 510080；9. 北京大学第一医院，北京 100034；10.华中科技大学同济医学院附属同济医院，武汉 4300030；11. 浙江大学医学院附属第一医院，杭州 310003；12. 杭州邵逸夫医院，杭州 310016 ；13. 浙江省人民医院，杭州 310014；14.中南大学湘雅医院，长沙 410008；15.天津医科大学总医院，天津 300052；16.哈尔滨医科大学附属第一医院，哈尔滨 150001；17.宁夏医科大学总医院，银川 750001；18.山东省立医院，济南 250021；19.广州医学院第一附属医院，广州 510120；20.辽宁省人民医院，沈阳 110000； 21.中国医科大学附属第一医院，沈阳 110001；22. 上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海 200025；23. 哈尔滨医科大学附属第四医院，哈尔滨 150001；24. 浙江大学医学院附属第二医院，杭州 310052]

侵袭性真菌病是临床的一类重要疾病，已成为医内感染的重要部分。随着易感人群的增加，侵袭性真菌病的发病率逐年上升，病死率居高不下[1]。最常见的病原菌是以念珠菌为主的酵母菌，其中，白念珠菌最多，其次为光滑念珠菌。中国医院侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)是中国首个针对侵袭性真菌病的全国性多中心研究。本研究作为CHIF-NET项目的一部分，收集了中国地区22家医院1619株酵母样真菌，通过菌种鉴定、体外药物敏感性等数据分析，为侵袭性酵母菌感染的诊治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集中国医院侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)中15个省份22家医院2012年度(2011年8月1日—2012年7月31日)门急诊及住院患者检出的侵袭性酵母菌菌株，同时收集菌株相关的临床及实验室信息，包括患者年龄、性别、菌株分离时患者所在的科室(门诊、急诊、病房，病房细分科室包括内科、外科、ICU、其他科室)。侵袭性酵母菌收集的标本类型包括外周血、其他部位(包括腹水、脓肿、静脉导管、脑脊液、肺泡灌洗液、胆汁、胸水、组织、关节积液和胃液)，剔除同一患者7 d内同一部位重复分离的菌株。

1.2 主要仪器与试剂

梅里埃基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(VITEK-MS)(法国bioMérieux公司)，科玛嘉显色培养基 (Chromagar)，沙堡弱培养基(sabouraud dextrose agar, SDA，英国Oxoid公司)，Mueller-Hinton琼脂(葡萄糖美兰MH琼脂)。氟康唑药敏纸片(25 μg,Oxiod)，伏立康唑药敏纸片(1 μg,Oxiod)，Mueller-Hinton琼脂(葡萄糖美兰MH琼脂)。

1.3 菌种鉴定

冻存菌种送至中心实验室(北京协和医院)后接种至念珠菌显色培养基，35℃孵育48 h后取单菌落于沙堡弱培养基(SDA)进行纯化孵育，采用Vitek MS进行复核鉴定, 对于疑难及少见菌株再进行ITS1/ITS4核糖体转录间区(rDNA internal transcribed spacer region，ITS)测序分析, 确保菌株鉴定的准确性。

1.4 体外药敏试验

将2%葡萄糖加入BBL Mueller-Hinton Ⅱ型的琼脂,再加0.5 μg/mL亚甲蓝，制备4 mm厚的琼脂板。将念珠菌落混入生理盐水制成0.5麦氏浊度的菌悬液，用一次性无菌棉拭子蘸取制备好的菌悬液均匀涂抹到琼脂表面。将氟康唑(25 μg/片)和伏立康唑(1 μg/片)纸片贴于琼脂表面，35℃孵育24 h。特殊生长缓慢的分离株(如隐球菌属)需延长培养。使用CLSI M44-A文件推荐的纸片扩散法测定氟康唑和伏立康唑的抑菌圈直径并根据CLSI菌种特异性折点对药敏结果进行判定。

以白念珠菌ATCC 90028和近平滑念珠菌ATCC 22019作为药敏质量控制菌。根据CLSI菌种特异性折点对药敏结果进行判定，针对白念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌采用CLSI M60念珠菌折点分析，对于其他念珠菌仍采用CLSI M44-S3进行分析。光滑念珠菌对于伏立康唑的敏感性根据流行病学折点(ECV)进行判定。分离株原始鉴定结果与复核鉴定结果对比中，显著错误(major errors)为菌种鉴定错误，非显著错误(minor errors)为正确鉴定到属，但未鉴定到种或正确鉴定到菌种复合体。

2 结 果

2.1 侵袭性酵母菌分布情况

CHIF-NET项目2012年度收集的1619个菌株中，白念珠菌整体分离率高达43.48%(见表1)。念珠菌属中白念珠菌所占比例47.4%，其次为热带念珠菌(18.0%)、近平滑念珠菌复合体(16.2%)、光滑念珠菌复合体(12.0%)。隐球菌属中，97.1%为新生隐球菌复合体，毛孢子菌属总体少见，其中最长见的仍为阿萨希毛孢子菌(77.8%)，具体情况见表2。

表1 1619株酵母菌菌种分布情况

表2 1619株酵母菌样本分布情况分析

2.2 样本分布

样本类型中，血流来源的标本类型菌株数量最多(626株，38.7%)，其次为腹水标本(354株，21.9%)及脓肿(159株，9.8%)。念珠菌属在大部分的标本类型中最为常见，其中在血流标本分离菌株中占94.4%(591株)；相比血流中隐球菌仅为3.4%(21株)。念珠菌属中常见的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌等菌种，非血流标本比例大于血流标本比例(血流标本比例：25.0%～41.6%)。相比，近平滑念珠菌复合体在血流标本的比例(154/472)明显高于非血流标本(见表1)。

2.3 患者性别比例、年龄分布

检出侵袭性酵母菌患者中男性占比一半以上(62.14%)，女性患者相对较少(37.80%)；年龄范围0～94岁，其中≥65岁患者498例(30.76%)。

2.4 科室分布

在分离的菌株中，急诊患者5.37%(87例)，门诊患者3.15%(51例)，未知病区患者54例。1427(88.14%)例住院患者中，内科检出24.21%(392例)，外科27.24%(441例)，ICU29.28%(474例)，其他科室(包括儿科、妇产科、皮肤科、五官科、中医科病房等)占比较少(共7.41%)。检出率最高的科室为ICU。

2.5 菌株鉴定复核情况

CHIF-NET 2012年中所有收集的菌株采用Vitek MS进行鉴定，质谱鉴定未出结果的菌株采用分子测序方法进行进一步鉴定。Vitek MS和ITS测序鉴定发现，复核鉴定与原始鉴定的一致率为87.28%(1413/1619)。以复核鉴定的结果为准，评价项目中各单位常规方法鉴定结果的准确性，其中4株拟平滑念珠菌被错误鉴定为近平滑念珠菌，25株热带念珠菌被错误鉴定为白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌。错误鉴定的菌还有白念珠菌、光滑念珠菌，也包括葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、解脂念珠菌等临床非常见菌株(见表3)。

表3 1619株分离株原始鉴定与复核鉴定对比

(续表) %

2.6 体外药敏试验

1619株分离株药敏结果见表4，念珠菌属中常见的白念珠菌对氟康唑较为敏感(99.2%)，其次为近平滑念珠菌复合体和热带念珠菌，依次为93.7%和91.7%。白念珠菌、近平滑念珠菌复合体和热带念珠菌对伏立康唑敏感的菌株百分比分别为99.5%、95.0%、92.5%。分离株对氟康唑和伏立康唑的敏感程度从整体来看较接近。白念珠菌和近平滑念珠菌对两种唑类药物的敏感性都很高(>93%),热带念珠菌对氟康唑和伏立康唑的耐药率分别为6.3%和5.9%，其中6%出现交叉耐药。

表4 2012年CHIF-NET 1619株酵母菌氟康唑及伏立康唑体外药敏试验

(续表) %

2.7 不同菌株在各医疗机构的分布差异

虽然白念珠菌为临床最常见的念珠菌种，但其发生率在不同医疗机构存在显著差异，最高为北京协和医院(PU)，占12.78%，最低为浙江大学医学院附属第二医院(Z2)，仅占1.14%。除东北地区哈尔滨医科大学附属第一医院(H1)以外，白念珠菌是所有参与研究单位分离株中最常见的念珠菌种，热带念珠菌在近一半(45.45%)的医院是检出率排名第二的念珠菌种，发生率在16.67%～29.79%之间(见图1)。

图1 2012年参与CHIF-NET的22个监测点在全国的分布情况。BD：北京大学第一医院；FJ:福建医科大学附属协和医院；G1：广州医学院第一附属医院；GH：解放军总医院；GZ：中山大学附属第一医院；H1：哈尔滨医科大学附属第一医院；H4：哈尔滨医科大学附属第四医院；HX：四川大学华西医院；JS：江苏省人民医院；LR：辽宁省人民医院；NX：宁夏医科大学总医院；PU：北京协和医院；RJ：上海市瑞金医院；SD：山东省立医院；TJ：华中科技大学同济医学院附属同济医院；TZ：天津医科大学总医院；XY：中南大学湘雅医院；Z1：中国医科大学附属第一医院；Z2：浙江大学医学院附属第二医院；Z3：浙江省人民医院；ZD：浙江大学医学院附属第一医院；ZS：杭州邵逸夫医院

3 讨 论

CHIF-NET 2012中国多中心侵袭性酵母菌感染的临床研究结果表明：念珠菌属仍然是最常见的侵袭性酵母菌感染病原体，占分离株的91.8%,其中白念珠菌最为常见占47.4%，与文献报道一致[2]。在血流样本分离株中，白念珠菌的分离率依然位居榜首(34.0%)，这一点不同于美国(38.0%)[3]。由非白念珠菌引起的菌血症超过一半[4-5]，近平滑念珠菌和热带念珠菌是位于第2、3位的导致血流感染的病原菌(见表2)。在全球范围内，白念珠菌仍是主要病原菌。

从流行病学角度分析，纳入研究的病例中，男性占62.1%，女性占37.8%，其中≥65岁患者占30.76%，长期使用抗菌药物的高龄患者易感染。本监测显示，ICU检出率最高，其次为外科及内科。全球范围内ICU侵袭性真菌感染的问题亦很严峻[6]。本研究对2012年22家参与单位侵袭性酵母菌分布特点及体外药敏结果做了研究分析，为酵母菌感染的诊治提供依据。

研究对1619株真菌进行了复核鉴定，复核正确率为87.2%。由于目前实验室常规基于生化鉴定的方法不能区别鉴定到种水平，其中25种似平滑念珠菌被鉴定为近平滑复合体。此外，还有部分菌株无鉴定结果如季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌。临床对于侵袭性真菌病的诊治取决于分离菌株的正确鉴定与否，故实验室在真菌的诊断方面，不仅需要使用常规的表型鉴定方法，还需要结合分子生物学的方法进行确认，研究可以看出，参与的医疗机构利用常规的监测手段鉴定念珠菌的准确率仅为60.1%，其中出现把季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌、近平滑念珠菌等错误鉴定为无名念珠菌的情况，研究中亦发现毛孢子菌属的鉴定错误，其中3株阿萨希毛孢子菌被错误鉴定为白念珠菌，这可能和表型鉴定错误相关。而测序方法虽准确性高，但也有一定的局限性，如方法缺乏标准化，成本也相对较高。综合考虑，想要兼顾准确性及较低的成本，VITEK MS略显其优越性。

研究中大部分的白念珠菌(79.83%，736/922)、光滑念珠菌(87.08%，155/178)、近平滑念珠菌(93.78%，226/241)对氟康唑和伏立康唑较敏感，伏立康唑对克柔念珠的敏感性可达91%以上，侵袭性真菌感染的药物治疗中氟康唑不良反应小，氟康唑的大量使用已使念珠菌病的致病菌谱发生了显著变化，对氟康唑的敏感性也明显下降。唑类是治疗念珠菌感染最常用的药物，除了固有耐药比如克柔念珠菌，其他念珠菌如白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌在长期用药以及过度用药的情况下亦会出现耐药[7-11]。近平滑念珠菌对棘白菌素类药物MIC和其他念珠菌比较相对较高[12]，因此唑类耐药的近平滑念珠菌将限制临床的可用治疗方案，对临床意义重大[13]。除此之外，也有少见的念珠菌出现唑类交叉耐药的情况，如5.99%的热带念珠菌和4.56%的近平滑念珠菌出现了氟康唑和伏立康唑的交叉耐药，出现在非同一医疗机构中。CHIF-NET2012研究中热带念珠菌的交叉耐药率已经高于近平滑念珠菌复合体和白念珠菌，尤其是血流感染，应引起关注。