MADLI-TOF MS自建库在马尔尼菲篮状菌快速鉴定中的应用

郭鹏豪 伍众文 邱丹萍 谢梅英 刘敏 廖康

(1.中山大学附属第一医院检验科,广州 520080； 2.广西玉林市人民医院检验科,玉林 537000；3.广西防城港市人民医院检验科，防城港 538000)

马尔尼菲篮状菌(Talaromycesmarneffei)既往称为马尔尼菲青霉[1-2]，1956年由Capponi等从中华竹鼠中分离出来[3]。该菌是一种双相真菌，在不同温度下具有不同的菌落形态[4]。在HIV/AIDS患者中，马尔尼菲篮状菌是仅次于结核分枝杆菌和隐球菌的第三大病原体[5]。在香港约有10%的HIV/AIDS患者感染马尔尼菲篮状菌[6]。作为临床侵袭性真菌感染的重要病原体之一，目前马尔尼菲篮状菌鉴定主要依赖于传统的形态学鉴定和基因测序。然而形态学鉴定耗时、准确率低；基因测序目前难以在临床实验室中常规进行。因此，如何准确、快速地鉴定马尔尼菲篮状菌仍然是一个难题。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是一种革命性的病原体鉴定技术，其鉴定速度快、准确性高[7]。Vitek MS是法国生物梅里埃公司生产的一种商业化用于病原体鉴定的质谱仪。目前Vitek MS的IVD数据库(版本3.0)和RUO SARAMIS数据库(版本4.14)均无法对马尔尼菲篮状菌进行鉴定。本研究通过在Vitek MS的RUO模式建立包含马尔尼菲篮状菌超级图谱的自建库，实现Vitek MS对马尔尼菲篮状菌进行快速、准确的鉴定。

1 材料与方法

1.1 菌株

共收集马尔尼菲篮状菌41株，包括40株临床菌株(剔除同一患者的重复菌株)和标准菌株ATCC18224。临床菌株来自广东省广州市(6株)，广西壮族自治区玉林市(20株)和广西壮族自治区防城港市(14株)。标准菌株ATCC18224和15株临床菌株(每个城市随机选取5株菌)用于建立马尔尼菲篮状菌自建库(见表1)；其余25株非建库的马尔尼菲篮状菌及30株临床常见的其他真菌(白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、茄病镰刀菌、小孢根霉、红色毛癣菌、橘青霉、宛氏拟青霉、短帚霉各2株)用于验证建立的自建库。

表1 用于自建库建立15株马尔尼菲篮状菌的标本信息

1.2 主要试剂和仪器

真菌基因组DNA提取试剂盒与蜗牛酶购自上海生工生物工程股份有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Taq酶及PCR反应体系购自TaKaRa公司；ABI 9700扩增仪；Vitek MS质谱仪购自法国生物梅里埃公司；沙堡弱平板(SDA)购自法国生物梅里埃公司；马铃薯葡萄糖琼脂平板(PDA)购自中国江门凯林贸易有限公司。

1.3 马尔尼菲篮状菌菌株的分子生物学鉴定

所有临床分离马尔尼菲篮状菌菌株鉴定通过ITS序列的测序分析。DNA提取操作严格遵守真菌基因组DNA提取试剂盒说明书。采用通用引物ITS1和 ITS4进行扩增，其中ITS1的碱基序列为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4的碱基序列为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反应体系：DNA模板 5 μL，引物ITS1和ITS4各1 μL，dNTP Mixture 4 μL，10×PCR buffer 5 μL，Taq酶0.5 μL，加灭菌双蒸水至50 μL。反应条件：94℃预变性5 min， 94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行35个循环，最后72℃延伸7 min，-20℃保存。将PCR产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序。测序结果与GenBank 中已知标准或临床菌株DNA序列进行比对，一致性≥99%时可确定至菌种水平。

1.4 建库菌株质谱数据的获取

每株马尔尼菲篮状菌接种4个培养基：2个PDA平板和2个SDA平板；其中1个PDA平板和1个SDA平板置于37℃孵育，另外1个PDA平板和1个SDA平板置于28℃孵育；所有的菌株均培养6 d。培养的第4 d、5 d、6 d用无菌棉签刮取建库菌株在不同培养条件下的菌落，通过微型玻璃珠研磨结合甲酸/乙腈提取法进行预处理，在Vitek MS质谱仪RUO模式下采集不同平板、不同时间点菌丝相和酵母相菌落的质谱数据。每株菌重复检测两次。

菌株的预处理步骤：①将菌株转移至含有微型玻璃珠及900 μL 70%的乙醇溶液的EP管，震荡2 min，静置。②静置后的菌液转移至新的EP管中，13000 min离心2 min，弃去上清液，晾干。③向EP管中加入70%的甲酸溶液，震荡1 min，加入40 μL乙腈，继续震荡1 min；13000 r/min离心2 min。④吸取1 μL上清液涂于靶板，晾干后加1 μL CHCA基质液覆盖，待干燥后放入Vitek MS仪器，在RUO模式下进行检测，获取菌株的图谱。

1.5 自建库的建立

将ATCC 18224和15株临床建库菌株的质谱数据导入SARAMIS Premium软件。通过聚类分析对所有的图谱进行分析。根据聚类分析的结果，将异常值从数据库中删除。根据SARAMIS手册中制造商的描述，按照SARAMIS Premium工具创建超级图谱。最后将建立的超级图谱添加到SARAMIS数据库并激活，建立含有马尔尼菲篮状菌超级图谱的自建库。

1.6 自建库的准确性验证

用无菌棉签刮取马尔尼菲篮状菌非建库菌株在PDA平板和SDA平板培养成熟的菌丝相菌落和酵母相菌落，通过与建库菌株相同的方法进行预处理后，在Vitek MS的RUO模式下进行检测，并通过自建库对菌株进行鉴定。置信度值为80%被认为是可靠的鉴定结果。如果第1次无法鉴定，则按照上述流程再次进行检测。 如果第2次仍然无法鉴定，则认为鉴定失败。另外30株临床常见的真菌根据厂家念珠菌及丝状真菌的操作流程进行前处理，并利用自建库进行鉴定。

2 结 果

2.1 菌株鉴定

PCR扩增产物经电泳检测以后，均扩增出长度为600bp左右的条带。使用Vector NTI软件程序对测序获得的核苷酸序列进行校准。校准后的序列在NCBI数据库中进行比对后显示与马尔尼菲篮状菌具有99%的一致性。所有临床菌株均鉴定为马尔尼菲篮状菌。

2.2 马尔尼菲篮状菌自建库的建立

通过对建库菌株的质谱检测，共获得了384个质谱图。其中40个质谱图由于数据质量差被剔除，其余的344个质谱图数据被导入SARAMIS Preminm软件包。通过SARAMIS软件进行聚类分析，聚类结果显示在不同条件下培养的同一菌株的质谱图之间没有明显的差异。不同平板、不同培养时间和不同温度下菌株的质谱图非常相似(见图1)。根据厂家说明书关于超级图谱的建立流程，使用SARAMIS Preminm软件建立了包含39个特征峰的马尔尼菲篮状菌的超级图谱(见图2)。建立超级图谱后，将该超级图谱进行激活，对SARAMIS Preminm数据库进行扩展，建立马尔尼菲篮状菌自建库。

图1 ATCC 18224在不同培养条件下菌落的质谱图

2.3 自建库的验证

在培养的第4天，采集24株非建库马尔尼菲篮状菌在PDA和SDA上的酵母相和菌丝相菌落，通过微型玻璃珠研磨结合甲酸/乙腈提取法进行预处理，在Vitek MS的RUO模式下利用马尔尼菲篮状菌自建库进行鉴定；另外1株菌由于生长缓慢，其检测和分析在培养的第6天进行。25株马尔尼菲篮状菌在PDA、SDA培养基上的酵母相和菌丝相菌落均鉴定为马尔尼菲篮状菌，准确率为100.0%；另外30株临床常见的真菌均准确鉴定到种。部分验证菌株的质谱图谱见图3。

图2 含有39个特征峰的马尔尼菲篮状菌超级图谱 图3 马尔尼菲篮状菌与短帚霉、拟青霉的图谱结果

3 讨 论

马尔尼菲篮状菌是一种双相真菌，可以引起身体多部位的感染，包括肺部、淋巴结、血液和软组织等。菌株的快速、准确鉴定对患者的诊断、治疗和改善预后具有重要的作用。但是，传统的形态学鉴定对于实验室操作人员的经验要求高，耗时长，经常鉴定错误，从而延误治疗。基因测序是马尔尼菲篮状菌鉴定的金标准，通过特异性引物对内转录的间隔区(ITS)和5.8S rRNA基因进行扩增、测序[8]，但是尚无法在临床微生物实验室常规开展检测。

MALDI-TOF MS质谱技术改变了传统的微生物鉴定方法，可以在几分钟内提供菌株的鉴定结果。该技术操作简单、成本低、准确率高[9]，对细菌、真菌和分枝杆菌具有良好的鉴定能力[10]；其通过获取微生物的蛋白图谱，并与数据库中已知微生物的图谱进行比对，根据最接近的匹配关系达到对未知菌株的鉴定。目前主流的商业化MALDI-TOF MS质谱仪数据库均不包括马尔尼菲篮状菌的超级图谱。因此有必要建立马尔尼菲篮状菌质谱鉴定的方法。

质谱鉴定的结果会受到培养基基质、培养条件、培养时间、菌株蛋白提取方法等因素的影响，如烟曲霉生长早期(48 h)鉴定效果差，培养72 h后准确率稳定[11]。李凤琴等[12]研究发现，培养条件的改变，会导致微生物内生物大分子发生变化。本研究将不同地区、不同生长阶段、不同温度和不同培养基等因素均考虑在内，在Vitek MS质谱平台成功构建含有39个特征峰的马尔尼菲篮状菌超级图谱，该研究结果与布鲁克平台上建立的超级图谱相似[13]。需要指出的是，本研究结果显示不同培养条件下获取的马尔尼菲篮状菌图谱无显著差异。通过SARAMIS高级软件聚类分析后显示在不同条件下培养的同一菌株的质谱图之间没有明显的聚类现象。Lau等[7]的研究也发现了类似的结果，在其研究中马尔尼菲篮状菌的菌丝相和酵母相培养物的图谱相似。由于本研究的菌株数量有限，仍需进一步扩大菌株的数量进行验证才能得出更为确切的结论。

本研究建立的自建库对于马尔尼菲篮状菌具有很高的鉴定准确率，其准确率达100.0%，与Lau等[7]的研究结果一致。经过验证，也进一步证实建立的自建库能够很好地将马尔尼菲篮状菌与临床其他常见的真菌进行较好的区分。本研究由于无篮状菌属内其他种的菌株，因此无法直接评估自建库将马尔尼菲篮状菌与其他篮状菌的区分能力，但是通过与SARAMIS Preminm数据库中自带的菌种，如紫色篮状菌、皱褶篮状菌的图谱具有明显的区别，通过聚类分析也能将马尔尼菲篮状菌与这些菌种进行较好的区分。

自建库的建立虽然有益于扩展现有数据库的鉴定能力，弥补鉴定方法的不足，但是也必须意识到自建库可能存在的风险。实验室使用自建库用于微生物的鉴定和报告，属于临床实验室自建项目(LDT)。LDT是实验室自行研发、验证和使用的检测项目，仅在研发实验室内部使用，不作为商品出售给其他实验室、医院及个人。作为临床实验室开展LDT，可参照相关技术指南中建议的模式在项目研发、项目投入临床检测前确认、项目投入临床检测后的质量监管流程做好LDT质量管理[14]。因此在日常工作中用自建库对马尔尼菲篮状菌进行鉴定时，仍然需要结合传统的形态学鉴定方法，当两者结果不一致时采用分子测序的方法进行进一步的鉴定。

综上所述，通过在Vitek MS平台建立超级图谱，对数据库进行扩展以后，实验室可以实现对于马尔尼菲篮状菌的快速和准确鉴定。同时表明Vitek MS质谱仪具有很强的扩展性。随着数据库的不断完善，MALDI-TOF MS不仅在细菌、念珠菌的鉴定方面具有巨大的优势，也势必成为解决丝状真菌快速、准确鉴定的一种方法。