土槿乙酸与氟康唑联合抗白念珠菌作用的研究

郝小康 王宇鹤 徐世林 李楠

(1.西藏民族大学附属医院检验科，咸阳 712082；2.陕西省西电集团医院检验科，西安 710077)

白念珠菌(Candidaalbicans)是一种机会性致病酵母菌，作为侵袭性真菌感染最常见的致病菌，可在免疫功能低下的个体中引发致命感染[1]。唑类抗真菌药物中,特别是氟康唑, 由于其疗效好、毒性小，在临床治疗中应用最多。然而，伴随着氟康唑广泛应用于白念珠菌感染，使得白念珠菌耐药率问题显著增多，不利于疾病治疗[2]。在临床治疗中，新型抗真菌药物的研发总是滞后于耐药性的增加，有效的抗真菌药物相对较少。近年来，研究者通过使用药物联合来克服耐药真菌的出现[3]。抗真菌药与非抗真菌药的联合用药成为研究的热点。两个药物对耐药菌株的协同作用可以通过降低真菌耐药性和增强抗真菌药活性的方式发生[4]。

土槿皮，为我国特有松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮。它的主要成分是土槿酸，包含土槿甲酸、土槿乙酸 (pseudolaric acid B，PAB)等一系列二萜酸化合物，土槿甲酸的研究主要在抗早孕及肿瘤细胞的细胞毒作用方面。土槿乙酸在抗肿瘤、抗真菌、调节免疫反应等方面发挥作用[5-6]，本研究小组前期研究发现土槿乙酸有抗白念珠菌及其生物膜的作用[7]。本研究拟通过棋盘式微量液基稀释法联合药敏实验，测定土槿乙酸联合氟康唑抗白念珠菌是否有协同作用。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株 临床标本中分离的20株氟康唑敏感的白念珠菌，10株来源于痰液，10株来源于阴道分泌物。8株氟康唑耐药的白念珠菌,5株来源于阴道分泌物，3株来源于痰液。4株光滑念珠菌、3株热带念珠菌、3株克柔念珠菌、3株新生隐球菌均分离自临床。质控菌株ATCC90028、ATCC90029、ATCC10231(购自北纳生物有限公司)

主要试剂 土槿乙酸和氟康唑(Fluconazole,FLZ)均购自上海源叶生物有限公司；二甲基亚砜 ( DMSO)购自Sigma Aldrich公司；SDA培养基购自郑州安图生物科技有限公司。RPMI-1640培养液(Gibco，31800-022，美国)：用RPMI-1640干粉配置，每10.4 g RPMI-1640溶解于1000 mL蒸馏水，加2.0 g用NaOH调节pH为7.0±0.1，0.22 μm滤过膜过滤消毒， 4℃避光保存。

1.2 方法

菌悬液的配置 将冻存在-75℃的菌株接种在SDA培养基，念珠菌35℃培养24 h后及隐球菌35℃培养48 h后，挑取SDA上的单个菌落，接种在分装好的5 mL的0.85%生理盐水中，涡旋震荡30s。使用RPMI-1640培养基结合牛鲍氏计数板将菌液浓度调整到(0.5～2.5)×103CFU/mL。

微量液基稀释法测定药物的体外抗真菌作用 参考CLSI推荐的M27-A3方案[8]及棋盘式微量液基稀释法[9]，即每孔加入100 μL 菌悬液(0.5～2.5)×103CFU/mL后，将药物(PAB与FLZ)分别进行倍比稀释。氟康唑选择行，A-H行氟康唑的浓度范围是0.5～64 μg/mL，土槿乙酸选择列，2～10列土槿乙酸的浓度范围是0.25～256 μg/mL。37℃培养24 h后，用肉眼观察药物的单独MIC和联合作用下的MIC。重复3次，结果取平均值；若平行实验的结果相差≥两个浓度时，则结果无效。与空白及阴性对照孔进行比较，土槿乙酸对念珠菌属和新生隐球菌的MIC取无菌生长的最小药物稀释度。把空白对照不生长、阴性对照生长当作实验有效的前提。两药之间的作用包括协同作用、拮抗作用和无关作用，本研究采用部分抑制浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)评价土槿乙酸与氟康唑之间的相互作用。A药和B药联合应用FICI抑制浓度指数计算公式：FICI = MIC(A in combination) /MIC(A alone) + MIC(B in combination)/MIC(B alone)，即FICI指数越小说明两种药物之间协同作用越大，当 FICI≤0.5时，两药的相互作用为协同作用；0.54时为拮抗作用。

统计学分析 将每种药物单用及分别联合时 MIC 值转换成对数后,进行配对资料的t检验，P<0.05时具有统计学差异。

2 结 果

检测氟康唑对20株氟康唑敏感白念珠菌以及8株氟康唑耐药白念珠菌的MIC范围分别为0.5～2 μg/mL、16～64 μg/mL，土槿乙酸对氟康唑敏感白念珠菌以及氟康唑耐药白念珠菌均具有一定的抗真菌作用，MIC范围分别16～128 μg/mL、16～64 μg/mL。应用棋盘式微量液基稀释法，两药联合作用对20株氟康唑敏感白念珠菌以及8株氟康唑耐药菌株的氟康唑MIC分别为0.5～2 μg/mL、0.5～1 μg/mL 。根据FICI计算公式判定，20株氟康唑敏感白念珠菌FICI>0.50，所有8株氟康唑耐药菌株FICI<0.50，即氟康唑与槿乙酸联合对所有氟康唑耐药菌株显示协同作用，对所有氟康唑敏感菌株显示为无关作用(见表1)。其中8株氟康唑耐药菌株FICI范围为0.03～0.19，中位数为0.07(见表1)。土槿乙酸对8株氟康唑耐药菌株的MIC值几何均数从32 μg/mL降至1.19 μg/mL (t=19.00，P<0.001)、氟康唑的MIC值几何均数从34.90 μg/mL 降至0.84 μg/mL (t=20.43，P<0.001)。

表1 土槿乙酸与氟康唑联合应用对20株敏感菌株和8株耐药菌株的MIC

Tab.1 In vitro effection of pseudolaric acid B and uconazole against 20 strains of FLZ-susceptible Candida albicans and 8 strains of FLZ-resistant Candida albicans

表1 土槿乙酸与氟康唑联合应用对20株敏感菌株和8株耐药菌株的MIC

菌株MIC(单独)MIC(联合)PAB/(μg·mL-1)FLZ/(μg·mL-1)PAB/(μg·mL-1)FLZ/(μg·mL-1)FICIATCC102313223211.50ATCC900283221621.50ATCC900293213212.00CA132140.51.13CA2641111.02CA3641211.03CA4641211.03CA5641111.02CA61281211.02CA7128120.50.52CA8641211.03CA9641211.03CA10641411.06

(续表)

土槿乙酸对非白念珠菌和新生隐球菌均具有一定的抗真菌作用，MIC范围分别为32～128 μg/mL、64～128 μg/mL。应用棋盘式微量液基稀释法，两药联合作用对10株非白念珠菌以及3株新生隐球菌的氟康唑MIC分别为0.5～64 μg/mL、0.5～2 μg/mL 。根据FICI计算公式判定，10株非白念珠菌和3株新生隐球菌FICI>0.50，即氟康唑与槿乙酸联合对所有非白念珠菌和新生隐球菌显示为无关作用(见表2)。

表2 土槿乙酸与氟康唑联合应用对非白念珠菌和新生隐球菌的MIC

3 讨 论

研究意义 近年来，研究者努力通过使用各种抗真菌药物组合来克服耐药真菌的出现。但是，治疗费用的增加和几种药物不良反应的叠加使得抗真菌药物的组合举步维艰。而且不同的研究机构报道的各种抗真菌药物组合的协同或拮抗作用并非一致，甚至是相互矛盾的结果。因此，目前的研究的重点已经转移到抗真菌药物与一些中药有效成分或者非抗真菌药物的组合。药物相互间抗耐药真菌的协同机制可以通过两种形式，其一是克服真菌耐药，其二是增强抗真菌活性。主要包括：①阻止真菌细胞膜上甾醇的生物的合成，升高真菌细胞膜的通透性；②减少药物外排，特别是通过抑制外排泵基因的表达；③抑制生物膜形成；④抑制钙调磷酸酶和热休克蛋白90(Hsp90)；⑤破坏细胞质离子稳态[10-12]。

结果分析 本研究中，我们主要研究土槿乙酸与氟康唑抗念珠菌及新生隐球菌的研究。在本课题组的前期研究中证实土槿乙酸有抗白念珠菌及其生物膜的作用，所以本实验主要是将土槿乙酸与氟康唑低于MIC的浓度来确定两种药物的联合效果，两种药物联合所测试的20株氟康唑敏感菌株FICI范围为0.51～2.0，氟康唑敏感菌株没有表现出协同作用。8株氟康唑耐药菌株FICI范围为0.03～0.19，全部表现为协同作用。测试的10株非白念珠菌和3株新生隐球菌FICI>0.50，全部显示为无关作用。

不足之处及展望 本实验研究了两种药物对 20株氟康唑敏感白念珠菌和8株氟康唑耐药菌株的相互作用，菌株样本相对较少。样本编号为17的白念珠菌FICI为0.51，已经接近协同作用判断标准的FICI值0.50。后续将针对该菌株做进一步研究。