沙门氏菌鉴定和分型方法比对研究

◎ 李赫婧，王立平，杨红莲，薛晨玉，王 丹

（北京市食品安全监控和风险评估中心，北京 100094）

沙门氏菌是食源性疾病重要的致病菌，我国每年由沙门氏菌引起的中毒事件屡居首位[1]。依据现有食品安全国家标准[2]，食品中沙门氏菌的鉴定和分型多采用常规生化鉴定的方法，检测周期长，操作烦琐，费力、耗时，无法满足食品安全突发事件应急检验的要求[3]。采用合适的鉴定和分型方法，对致病菌的快速溯源具有重要意义[4-5]。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOF-MS）是近几年发展起来的一种全新的用于微生物鉴定和分型的生物质谱技术，该方法基于细菌全细胞蛋白质组指纹图谱分析，通过与标准物质图谱数据库或者自建数据库进行比较，可以鉴定至属、种，乃至亚种的水平，具有快速、准确、通量高、成本低等优点，适用于微生物的高通量筛选[6-8]。传统的血清学分型使用血清玻片凝集作为早期沙门氏菌分型方法，该方法直观可靠，是大多数实验室使用的分型方法。但存在耗时长，对实验人员操作经验有要求，血清质量参差不齐而导致结果偏差等不足之处。多位点序列分型（MLST）是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，该方法通过对多个管家基因内部片段进行序列测定，分析菌株的变异，配合使用EnteroBase数据库提供的物种持家基因信息比对获得沙门氏菌各菌株的MLST分型，从而为沙门氏菌分型提供更高的分辨力和更明确的分型方法[9-10]。

本文采用生化鉴定和MALDI-TOF-MS对鸡肉中分离的沙门氏菌进行种属鉴定，采用传统血清学方法和MLST分子手段进行血清型分型，比较不同的技术手段具有的优缺点，剖析其方法机制，为实验室进行沙门氏菌鉴定以及权衡每种分型技术的利弊提供参考，使实验室能更好地根据菌株特性、分型目的和实验室拥有的条件选择合适方法进行相关研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

生鸡肉样品，购自北京市市场；BPW培养基、XLD培养基、SC培养基、营养琼脂、营养肉汤、SWARM琼脂等，购自北京陆桥培养基公司；沙门显色培养基，购自法国科玛嘉公司；肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒，购自法国梅里埃公司；沙门氏菌诊断血清，购自丹麦SSI公司；PCR预混液和细菌基因组DNA提取试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；引物，由北京生工生物技术有限公司合成；IVD BTS、IVD HCCA，购自德国布鲁克公司；乙腈、乙醇、三氟乙酸、甲酸和无水乙醇，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Sigma 3K18离心机、电热恒温水浴、Bio-RAD MyCyclerTM PCR仪、Bio-RAD电 泳 仪、Bio-RAD Gel Doc XR凝胶成像分析系统、布鲁克基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、Nanodrop分光光度计。

1.3 沙门氏菌初筛

参照GB 4789.4—2016[2]方法进行生鸡肉中沙门氏菌的初筛。无菌操作称取25 g样品，置于盛有225 mL BPW的无菌均质袋中，均质1 min左右，于36 ℃培养箱中培养18 h。各移取1 mL增菌液转接种于10 mL TTB和10 mL SC内，分别于42 ℃和36 ℃培养箱中培养24 h。取TTB及SC培养液各1环，分别接种于一个BS琼脂平板、一个XLD琼脂平板和一个沙门氏菌显色平板，于36 ℃培养箱中分别培养48 h、24 h和24 h，观察菌落形态，挑取可疑菌落进行后续试验。

1.4 生化鉴定

挑取1.3中初筛可疑沙门氏菌使用肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒进行生化鉴定，参照其说明书进行操作，将各反应管结果记录于报告单上。计算数据得到7位数字编码，通过APILAB PLUS鉴定软件得到鉴定结果。

1.5 质谱鉴定

使用MALDI-TOF-MS进行质谱鉴定，挑取1.3中初筛可疑沙门氏菌涂抹在样品靶板上，滴加1 μL 70%甲酸，室温干燥，再滴加1 μL HCCA基质溶液，室温干燥，将靶板放入仪器内，设定检测参数，进行质谱数据采集。

1.6 MLST分型

挑取1.4中生化鉴定为沙门氏菌的菌落，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行沙门氏菌基因组提取，核酸质量使用Nanodrop分光光度计进行测定。选取沙门氏菌7个管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA进行MLST分型，7个基因的扩增引物和测序引物参照SN/T 4525.1—2016合成[11]。

PCR反应体系（20 μL）：PCR预混液（2×）10 μL，上游引物（10 μmol·L-1）和下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA模 板1 μL，超 纯 水7 μL。PCR反 应 条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃充分延伸5 min，最后4 ℃保存。

将PCR扩增产物送至生工生物技术有限公司进行测序，测序结果上传至EnteroBase数据库进行MLST分型。

1.7 血清分型

挑取1.4中生化鉴定为沙门氏菌的菌落，以生理盐水作为对照，参照GB 4789.4—2016[2]的方法进行O抗原和H抗原的血清分型。依次用O因子多价血清做凝集实验，判定O群，再进行O复合因子血清或单因子血清的核对。确定O价抗原因子后，根据H抗原表所述H因子血清检查其第一相和第二相的H抗原[12]。

2 结果与分析

2.1 生化鉴定结果

经过选择性平板分离初筛，31个生鸡肉样品中共筛出15株可疑沙门氏菌，对其进行API生化鉴定，结果显示其中11株为沙门氏菌属，生化型分为6704552和6704752两种，具体生化鉴定结果详见表1。

2.2 质谱鉴定结果

对15株可疑沙门氏菌进行MALDI-TOF-MS鉴定，将采集的质谱数据导入仪器中自带微生物指纹图谱库进行比对，比对运算后得到鉴定结果，查看鉴定分值，其中11株菌鉴定为沙门氏菌属，具体质谱鉴定结果详见表1。

表1 生化和质谱鉴定结果表

2.3 MLST分型结果

将MLST测序结果上传至EnteroBase数据库（http：//mlst.war-wick.ac.uk/mlst）进行在线数据分析，11株菌共包含5个ST型，其中ST19型（5株）、ST34型（1株）和ST29型（1株）预测为鼠伤寒沙门菌，ST11型（3株）预测为肠炎沙门氏菌，ST1628型1株（EnteroBase数据库中未对该ST型进行血清型预测）。MLST具体分型及预测血清型结果详见表2。

表2 MLST和血清分型结果表

2.4 血清分型结果

使用丹麦SSI血清对11株沙门氏菌进行血清学分型实验，共检出3种血清型，分别为3株肠炎沙门氏菌、7株鼠伤寒沙门氏菌和1株里定沙门菌，具体血清学分型结果详见表2。

2.5 生化和质谱鉴定结果比较与分析

本次对15株可疑沙门氏菌进行API生化鉴定和MALDI-TOF-MS质谱鉴定，结果显示两种方法对15株菌的鉴定结果均一致。生化鉴定和MALDI-TOF-MS鉴定均能较准确的鉴定到沙门氏菌属或种的水平，但是两者的检测用时和检测成本不同。相比较传统生化鉴定方法，质谱方法具有快速、成本低、结果重复性好等特点，一次实验可以同时检测96个样品，可作为沙门氏菌高通量初筛的方法，经初筛为阳性的目标菌再通过生化鉴定等金标准方法进行确证，这样会大大提高目标菌的发现率。

2.6 血清和MLST分型结果比较与分析

本次对11株沙门氏菌分别用血清和MLST进行分型，结果显示沙门菌血清型和ST型有高度的相关性，其中10株菌MLST的预测结果与血清学分型结果完全一致，ST11对应肠炎沙门氏菌，ST19、ST34和ST29对应鼠伤寒沙门氏菌，仅有一株菌（样品号LHJ-7）MLST分型为ST1628，EnteroBase数据库显示没有对应的预测血清型，其血清学分型结果为里定沙门氏菌，可能由于该菌株在某一MLST基因位点上有突变导致与血清学结果偏差。以血清分型方法为参照方法，本次实验MLST对沙门氏菌分型的准确度为90.9%（10/11）。

血清学与MLST在沙门氏菌分型上均表现出较好的鉴定能力，但血清分型操作相对复杂，对实验人员操作经验有一定要求，其检测结果受制于试剂质量，目前各厂商血清质量参差不齐，部分菌株由于变异存在无法分型或交叉凝集等错误结果。相比较于血清学分型，MLST分型具有操作相对简单、成本低、实验用时短、结果更加精准的优势。如将MLST与血清分型联合使用，先通过MLST对菌进行血清型预测，再有针对性的进行血清学分型实验，将会极大提高血清分型的效率，尤其对于一些不常见的血清型，往往需要全套的诊断血清进行分型，如果有血清预测结果，也会降低对血清试剂的依赖，降低实验成本。

3 结论

文章对生鸡肉样品进行沙门氏菌分离鉴定与分型，共分离出疑似沙门氏菌15株，同时采用API生化及质谱两种方法对沙门氏菌进行鉴定，共鉴定出11株沙门氏菌，结果显示生化与质谱鉴定结果一致。分别采用血清学和MLST两种方法对11株沙门氏菌进行分型，结果显示MLST共测出5种ST型，血清分型为3种。通过结果比较得出沙门菌血清型和ST型有高度的相关性，其中10株菌MLST的预测结果与血清学分型结果完全一致。

质谱方法具有快速、成本低、结果重复性好等特点，文章仅使用仪器自带数据库对沙门氏菌进行属水平的鉴定，如果通过自建数据库，可以对沙门氏菌进行种和亚种水平的鉴定，同时还具有良好的分型能力，可以作为沙门氏菌快速鉴定的一种补充方法。MLST操作简单，能快速得到结果并且便于不同实验室结果之间的比较，已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究。随着测序速度的加快、成本的降低以及分析软件的发展，MLST有望成为细菌的常规分型方法。