微生物法从头合成2-苯乙醇的研究进展

朱灵桓，徐沙，李由然，张梁，石贵阳*

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)2(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122)3(河北科技大学 食品与生物学院，河北 石家庄，050018)

2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE) 是一种效用普遍、价值可观的高级芳香醇，天然存在于多种蔬果、花卉的花叶或其萃取的精油中。由于2-苯乙醇具有令人愉悦的香味及稳定的性质，在食品、日化用品甚至医药等领域都具有非常广泛的应用[1-2]。国内外的2-PE年产量已突破1万t，并以每年10%～15%的速度快速增长，但仍然供不应求[3]。目前2-PE工业规模的生产方法主要是化学合成法，虽然产品市场价低，工艺成熟，但此类化学原料具有致癌风险，而且产物中常含有一些难以去除的副产物与杂质，导致产品质量差异较大，无法达到香料添加剂标准，极大限制了产品的使用范围[4]。采用物理方法从植物精油中直接提取2-PE，虽然产品纯度高且品质天然，但原料稀缺，提取成本高，难以满足市场需求。与此相比，微生物发酵法原料廉价易得，反应条件温和，对环境友好，其产品相当于物理提取法产品的天然质量，又具备化学合成法成本低廉的应用潜力，受到国内外研究者的关注[5]。本文主要论述了构建从头合成2-PE工程菌的代谢改造策略，并展望了合成2-PE的研究方向以及存在的问题，以期为微生物发酵法生产2-PE及其工业化提供支持。

1 微生物中2-PE的主要合成途径

多种酵母天然具有合成2-PE的能力，如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)[6]、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)[7-8]、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)[9]、季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)[10]和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[11]等，为微生物发酵法生产2-PE奠定了基础。一些原核微生物中虽然缺少关键酶导致无法合成2-PE，但其莽草酸途径(shikimate pathway)能够提供必要的前体物质苯丙酮酸，为合成2-PE创造了有利条件。

在酵母细胞中，2-PE的合成路径取决于培养基中氮源的种类。当L-苯丙氨酸作为唯一氮源时，酵母直接通过艾氏途径(Ehrlich pathway)对底物L-苯丙氨酸进行生物转化合成2-PE；当培养基使用丰富易利用氮源，如无机氮、尿素时，酵母细胞主要通过莽草酸途径以葡萄糖为底物从头合成2-PE，如图1所示。艾氏途径包括转氨、脱羧和还原3个反应，合成效率高，研究较为深入，然而以氨基酸为底物的多级生产模式限制了其作为生物合成方法的发展潜力[12]。另一方面，以葡萄糖为底物从头合成2-PE的方法虽然反应多且调控复杂，但其摆脱了以氨基酸作为底物的生产成本限制，并且在建立芳香族化合物合成的平台菌株方面意义重大，因此随着莽草酸途径相关研究的不断深入[13-15]，逐渐成为研究热点。以往的报道中采用了传统的方法，包括筛选高性能菌株，随机诱变，培养基和其他工艺优化等，为从头合成2-PE 的研究打下坚实基础。其中，酿酒酵母遗传背景清晰且对2-PE的耐受性较高，用于黄酒酿造的酵母天然合成2-PE的能力较强，马克斯克鲁维酵母的代谢改造潜力可观等，均为具有高产2-PE潜力的优良菌株。近年来，代谢工程改造策略也被用于进一步提高2-PE的产量，并取得了可观的成果，如表1所示。

图1 酵母中2-PE的合成途径Fig.1 Synthetic pathway of 2-PE in yeast

表1 不同微生物菌株合成2-PE的能力比较Table 1 Comparison of 2-PE production by different microorganism

2 酵母以葡萄糖为底物合成2-PE的代谢改造策略

酵母细胞中，以葡萄糖为底物的2-PE合成是通过基于莽草酸途径的芳香族氨基酸合成途径来实现的。芳香族氨基酸合成途径是酵母细胞内最为复杂的合成途径之一，其代谢途径长，支路多，存在多种抑制作用，涉及到胞内所有主要代谢途径，同时具有胞内最为复杂的调控机制，与之相关的代谢囊括了糖酵解途径、磷酸戊糖途径、葡萄糖吸收系统、柠檬酸循环等。目前，利用代谢工程从头合成2-PE的改造策略主要集中在增加前体供应、解除反馈抑制、减少副产物升成、增强关键酶活性和途径重构方面。

2.1 增加前体供应

莽草酸途径是生物合成各种芳香族衍生物不可或缺的途径，它始于磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP，来源于糖酵解途径)和赤藓糖-4-磷酸(erythrose-4-phosphate,E4P，来源于磷酸戊糖途径)的缩合，如图2所示。代谢通量分析表明，只有8%的PEP会流入莽草酸途径，而E4P的碳流量比PEP还要低一个数量级[20]。因此，有效碳通量的缺乏以及PEP和E4P之间流量的不平衡是阻碍2-PE合成的重要原因。通过代谢改造策略能够有效提高前体PEP和E4P流入莽草酸途径的通量，这在芳香族化合物的从头合成研究中已得到证实。GOLD通过敲除酿酒酵母中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1实现了PEP的积累[21]；GUO等[22]在酪醇合成的研究中，敲除丙酮酸脱羧酶基因PDC1以阻断PEP流向丙酮酸的合成方向，并在此基础上过表达磷酸酮醇酶基因xfpk，将存在于糖酵解和磷酸戊糖途径的重要中间代谢物果糖-6-磷酸直接转化为E4P[23]。增加前体PEP和E4P的供应对于从头合成2-PE也是至关重要的，这已成为最近研究中的热门策略。HASSING等[12]在酿酒酵母中过表达酮醇转移酶基因TKL1，并结合关键酶过表达等代谢工程手段将2-PE产量提高了1.4倍；另外，考虑到ZWF1的敲除会对细胞生长产生不利影响[24]，此改造策略中并未采用zwf1Δ菌株。本实验室在增加前体供应的研究中证实了与HASSING相似的结论[25]，即过表达TKL1能够增加E4P的积累，从而促进2-PE的合成。GU等[6]在解脂耶氏酵母中筛选并表达不同来源的磷酸转酮酶[26]，并敲除丙酮酸激酶增加了莽草酸途径前体E4P和PEP的积累，进一步解除3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，DAHP)合酶的反馈抑制后构建了高产2-PE的代谢工程菌株，将2-PE产量由出发菌株的8.48 mg/L提高至2 426 mg/L。值得注意的是，不同菌株之间的代谢差异可能造成适用的代谢策略差异[21,27]，并且由于PEP和E4P均为细胞代谢中重要的中间代谢物，增加前体供应需要与莽草酸途径中其他代谢改造手段共同作用，以便显著提高2-PE产量[23, 28]。

图2 酿酒酵母中2-PE的从头合成途径Fig.2 De novo synthetic pathway of 2-PE in S.cerevisiae注：CHO，分支酸；DAHP，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸；DAHP，二羟基丙酮磷酸；E4P，赤藓糖-4-磷酸；FBP，果糖-1,6-二磷酸；F6P，果糖-6-磷酸；GAP，D-甘油醛-3-磷酸；G6P，葡萄糖-6-磷酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；L-Phe，L-苯丙氨酸；PAC，苯乙醛；PPY，苯丙酮酸；PREP，预苯酸；PYR，丙酮酸；Ru5P, D-核酮糖-5-磷酸；R5P，D-核糖-5-磷酸；S7P，D-景天庚酮糖-7-磷酸；L-Trp, L-色氨酸；L-Tyr, L-酪氨酸；X5P, D-木酮糖-5-磷酸；1,3DPG，3-磷酸-D-甘油酰磷酸；2-PE，2-苯乙醇；2PG，2-磷酸-D-甘油；3PG，3-磷酸-D-甘油；6PG，3-磷酸-D-甘油；6PGL, 6-磷酸-D-葡萄糖酸-1,5-内酯

2.2 解除反馈抑制

微生物细胞中，一些关键步骤的碳代谢流决定了整体代谢水平及产物的生成量，是整个途径的限速步骤和合成瓶颈。DAHP 合酶和分支酸变位酶受到相应芳香族氨基酸的严格反馈抑制，是限制整条途径代谢流的调控位点。通过定点突变能够有效解除反馈抑制，加大途径的代谢通量[29]。LUTTIK等[30]发现抗反馈抑制突变体ARO4K229L在酿酒酵母中的过表达能够使2-PE的产量提高至220 μmol/L，但ARO7G141S的单独过表达并未产生显著影响。此后，一些有效的突变体如ARO3K222L[12]、ARO4K221L[31]等也被用于在酵母中解除抑制并提高2-PE的产量。研究表明，来源于原核微生物的突变基因的表达对增加莽草酸途径代谢通量的效果往往优于真核微生物基因[14, 25]，如aroGD146N[25, 32]、aroGS180F[6]、aroFfbr[33]等在构建芳香族氨基酸和芳香醇的合成菌株方面效果显著。另一方面，与酵母的分支酸变位酶不同的是，大肠杆菌中是由双功能酶PheA催化分支酸的变位和预苯酸的脱水反应，并受到L-苯丙氨酸的反馈抑制，是控制芳香族化合物合成的关键节点[34]。双功能酶PheA 由分支酸变位酶(chorismate mutase，CM)酶活区、预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase，PDT)酶活区和R-domain 调节区3个结构域组成，删除R-domain 能够有效解除L-苯丙氨酸对PheA 的反馈抑制，且对分支酸变位酶活性没有显著影响[32, 35]。因此，抗反馈抑制突变体pheAfbr被广泛用于克服2-PE的合成瓶颈，在大肠杆菌[17]、肠杆菌[36]、酿酒酵母[25]和毕赤酵母[19]中均能发挥作用，成为代谢改造策略中至关重要的一环。由于在莽草酸途径中，细胞对于关键酶的调控非常严格，因此代谢改造中往往需要解除多种酶反馈抑制的协同作用。

除了研究较为透彻的DAHP合酶和分支酸变位酶，酵母细胞中还存在着其他影响2-PE合成的关键酶，具有相当大的研究潜力。酵母细胞的五功能酶Aro1p能够缩短底物通道，结构功能复杂的亚基之间联系紧密，但与之相关的调控机制鲜有报道。与研究较为透彻的大肠杆菌中具有相似功能的酶对比，如图3所示，同样是催化DAHP到5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)的合成，大肠杆菌编码莽草酸脱氢酶的基因aroE、编码莽草酸激酶的基因aroL均受到中间产物莽草酸的反馈抑制，编码莽草酸激酶的基因aroK受到L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的反馈抑制，这对酿酒酵母的五功能酶Aro1的调控机制研究也能够起到一定的借鉴作用。GOLD等[21]指出加大上游基因ARO4表达强度会引起中间代谢物莽草酸的大量积累，而通过过表达大肠杆菌来源的莽草酸激酶aroL和莽草酸脱氢酶ydiB能够有效疏通途径中代谢通量的阻塞[25]。另外，LIU等[37]在高产2-PE的黄酒酵母中发现其预苯酸脱水酶发生突变(I161K、L239P和Q250H)，且存在L-苯丙氨酸的保守结合位点，这使其具有较高的底物亲和力、催化效率和热稳定性，但不容易受到反馈抑制。

图3 大肠杆菌与酿酒酵母途径比较Fig.3 Comparison of synthetic pathways between E.coli and S.cerevisiae

2.3 减少副产物生成

酵母的莽草酸途径中，预苯酸脱水生成性质不稳定的苯丙酮酸，而后可通过可逆的Aro8p和Aro9p转氨生成L-苯丙氨酸供酵母生长所需，也可通过Aro10p的脱羧生成苯乙醛后，再还原生成2-PE或者氧化生成苯乙酸。以合成2-PE为目标的代谢改造策略中，L-苯丙氨酸和苯乙酸都是可能造成代谢分流的副产物。L-苯丙氨酸是必需氨基酸，且L-苯丙氨酸与苯丙酮酸之间的转氨反应是可逆的，因此为避免影响细胞正常生长，需要选择性敲除ARO8或ARO9以弱化支路途径。ROMAGNOLI等[38]构建了aro8Δ菌株，在以硫酸铵为唯一氮源的葡萄糖合成培养基中能够促进2-PE的合成。ZHU等[25]将敲除ARO9与过表达ARO10相结合，在非氨基氮源培养条件下将2-PE产量提高了2.3倍，达到116 mg/L。虽然有报道称Aro8p是酵母中起主要催化作用的芳香族氨基酸转氨酶，但2-PE合成菌株的特性、培养条件甚至诱导因素存在着差异，使得适用的代谢策略有所不同。苯乙醛是不稳定的化合物，能够被氧化为苯乙酸，降低2-PE的产量，而通过敲除ALD2和ALD3[39]可以降低苯乙酸方向的分流。另外，其他竞争途径的阻断也能促进2-PE合成。HASSING等[12]证实，在酿酒酵母中表达丙酮酸激酶基因PYK1D146N并敲除酪醇合成途径，能够有效提高2-PE的产量至13 mmol/L。

2.4 增强关键酶活性

在酵母细胞中，苯丙酮酸脱羧酶在芳香族氨基酸的代谢途径中的作用为催化苯丙酮酸脱羧形成苯乙醛，是由L-苯丙氨酸生成2-PE的必经途径。酵母中编码苯丙酮酸脱羧酶的基因包括ARO10、PDC1、PDC5、PDC6及THI3，VURALHAN等[40]的研究发现，以不同氮源为培养条件时，上述5个基因的转录水平差异很大，L-苯丙氨酸能够诱导ARO10的转录水平提高至其他基因的30倍以上，说明酿酒酵母的艾氏途径中Aro10p是起主要作用的苯丙酮酸脱羧酶。Aro10p具备较为广泛的底物范围，能够催化包括甲硫氨酸、以及所有芳香族氨基酸在内的转氨产物的脱羧反应[41-43]。酵母细胞对苯丙酮酸脱羧酶存在严格而复杂的调控机制。Aro10p在氮源丰富的培养基条件下不表达，在氮源贫乏的培养基条件下能够被L-苯丙氨酸或色氨酸、甲硫氨酸等诱导表达，此诱导作用与Aro80p[44]上游激活序列相关，但具体调节方式位点和调控强度尚不清楚，成为了精细代谢改造有待解决的关键问题。KIM等[16]在解除了DAHP合酶反馈抑制的克鲁维酵母中，过表达酿酒酵母来源的苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10和脱氢酶基因ADH2，得到2-PE 产量约1.3 g/L。KONG等[19]在解除了DAHP合酶和分支酸变位酶反馈抑制的毕赤酵母中，过表达ARO8-ARO10-ADH6，以葡萄糖为底物合成2-PE达到1.17 g/L。

2.5 重构代谢途径

近年来，通过在大肠杆菌细胞中重构合成途径得到2-PE产品的成果颇丰。由于缺乏2-酮酸脱羧酶，大肠杆菌无法通过艾氏途径合成2-PE，因此在解除代谢流量瓶颈的基础上，必须同时在大肠杆菌中异源表达酮酸脱羧酶才能够实现2-PE的积累。KANG等[45]通过优化大肠杆菌来源的基因aroF、pheA与酵母来源的脱氢酶基因ADH1和脱羧酶基因KDC的协同表达，将2-PE产量由57 mg/L提高到285 mg/L。GUO等[17, 46]在解除反馈抑制的大肠杆菌中引入了异源的转氨酶基因ARO8、脱羧酶基因KDC和还原酶基因yjgB，成功构建了艾氏途径关键酶联合表达体系，得到1.016 g/L 2-PE。大肠杆菌作为遗传背景清晰、调控相对简单的模式生物，因其代谢改造便捷、产物积累量高，一直以来深受研究者青睐。由于利用大肠杆菌生产芳香族氨基酸的研究成果已达到工业化水平，莽草酸途径畅通流量大，为合成相应芳香醇打下了扎实的研究基础。但是，2-PE作为香料被广泛应用在食品、日化用品与医药行业，使得以大肠杆菌作为宿主的生产方法无可避免地存在应用范围方面的缺陷。在酵母的途径重构方面，MO等[47]在酿酒酵母中过表达异源酶，重构了一条“苯乙烯-2-PE途径”。通过整合来源于拟南芥的苯丙氨酸解氨酶基因PAL2、来源于酿酒酵母的阿魏酸脱羧酶基因FDC1以及来源于恶臭假单胞菌的氧化苯乙烯异构酶基因SOI和苯乙烯单加氧酶基因SMO，得到了680 mg/L的胞外2-PE。

3 2-PE的合成前景与展望

2-PE作为一种在食品、医药和日用化工行业应用广泛的芳香醇，受到越来越多的关注。随着人们对2-PE在安全性和生产成本方面的要求不断提高，开发绿色高效的合成方法势在必行。利用莽草酸途径从头合成2-PE具有良好的应用前景，合成代谢的途径、相关基因及调控位点已非常清晰，为相关研究的开展提供了充足的理论基础。除了传统的基因敲除、表达和调控等代谢工程手段外，还有望通过挖掘有潜力的关键基因和协调细胞内代谢网络来实现2-PE的高产。

3.1 挖掘关键基因

基于对高产2-PE菌株的组学分析(比如将基因组学、转录组学与蛋白组学相结合)，能够挖掘出促进合成2-PE的关键基因，并且需要通过基因编辑与发酵实验进一步验证其作用，实现理性改造。随着从头合成2-PE相关研究的不断深入，如何高效利用葡萄糖底物、平衡细胞生长与2-PE合成之间的关系成为提高2-PE产量的难点。与大肠杆菌磷酸转移酶基团吸收葡萄糖的方式不同，酵母是通过己糖转运蛋白进行葡萄糖的运输，转化效率更高。其中，酿酒酵母的HXT7(YDR342C)编码高亲和性的葡萄糖转运蛋白，在糖浓度较高时其表达水平会被抑制，这可能与大部分研究中2-PE合成的最适条件(培养基中葡萄糖质量浓度一般为20 g/L)存在关联；HXT11(YOL156W)能够运输多种底物，包括葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖等，其改造能够为利用更多种糖类从头合成2-PE创造可能。另外，芳基醇脱氢酶(aryl-alcohol dehydrogenases，AAD)中的Aad1p和Aad6p对苯乙醛亲和力较高[48]，具有进一步研究的价值。

3.2 协调代谢网络

微生物从头合成2-PE涉及众多代谢途径，协调细胞内代谢网络以促进2-PE的合成将会是未来研究的重点。除了增加前体供应、减少副产物生成等，还可以利用对NADH 激酶的调控、NADP+依赖型脱氢酶的增强以及支路代谢途径的重构，将辅因子最大化地流向合成2-PE的途径。另外，培养基中含有无机氮等易利用氮源时，细胞中的氮分解代谢物阻遏作用(nitrogen catabolite repression，NCR)会抑制2-PE的产生。结合对2-PE合成途径的改造，对NCR相关基因进行转录调控有望缓解这种抑制作用。微生物合成2-PE还存在着一个瓶颈，即2-PE对细胞生长具有抑制作用， 但微生物对2-PE的耐受机制尚不清楚[49]，需要进一步基于组学数据的研究来揭示其机制。

综上所述，2-PE合成途径的研究对于促进传统食品发酵工业的现代化、新型芳香族化合物生产菌株构建和丰富酿酒酵母代谢改造元件方面都具有重要价值，构建新型的高发酵强度和高转化率生产菌株意义重大。