褪黑素处理对草莓品质与活性氧代谢的影响

黄鸿晖，顾里娟，李美琳，郑永华，金 鹏*

（南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095）

草莓（Fragaria ananassaDuch.）柔软多汁、酸甜可口，且富含维生素、矿物质、花青素等营养成分。由于果实采后活性氧（reactive oxygen species，ROS）代谢平衡被破坏，ROS会迅速累积，从而加剧细胞膜的膜脂过氧化作用，造成细胞质膜结构损伤以及区域化分布体系被破坏，最终加速果实衰老。植物细胞内已经形成了系统的防御ROS、自由基毒害的机制[1]。现如今也已经出现了很多例如硫化氢（H2S）、外源NO、亚硝酰氢、2,4-表油菜素内酯处理等提升草莓果实采后抗氧化能力、延缓果实品质下降的保鲜措施，能够延长草莓货架期[2-5]。然而，H2S和NO等化学处理有可能会对人体有毒害作用，因此亟需寻求一种高效安全的保鲜措施。

近年来，褪黑素（melatonin，MT）作为一种绿色安全的保鲜物质进入研究人员的视野。MT是一种内源激素，可以在植物中或者动物的松果体中产生。现已发现，许多水果和蔬菜中都产生内源性褪黑激素，并且起着重要的作用。研究人员已经在几种水果中检测到褪黑激素，包括香蕉[6]、草莓[7]、苹果[8]等。已经有文献证明外源MT处理采后果蔬能够维持果蔬的品质并增加其抗氧化能力，从而延长货架期。Gao Hui等[9]研究证实褪黑激素与植物的衰老有关，他们发现MT处理能有效地减缓桃果实的衰老过程，主要体现为质量损失减少，腐烂发生率和呼吸速率降低，并保持了硬度、总可溶性固形物和抗坏血酸（ascorbic acid，ASA）含量，MT处理显著提高了两个品种桃果实中的过氧化物酶（peroxidase，POD）与过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化酶的活性，降低了脂氧合酶的活性，超氧阴离子自由基（O2-·）和H2O2的水平以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，表明MT处理能维持果蔬采后的品质并增加抗氧化能力。Ma Qiuxiang等[10]发现，质量浓度500 mg/L MT处理可通过直接或间接调节细胞ROS含量来延迟木薯生理退化，且铜/锌超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、CAT1、谷胱甘肽过氧化物酶、CAT3和谷胱甘肽S-转移酶基因的相对表达量受MT调控而显著提高。但是，关于MT作为采后处理保鲜剂对草莓果实采后的保鲜效果研究很少，且缺少MT处理对采后草莓的ROS代谢的系统研究，因此，本研究探索了不同浓度MT处理对草莓贮藏过程中品质和抗氧化能力的影响，并选用其最佳施用浓度处理草莓，探索其对草莓抗氧化能力的影响，为MT在草莓果实保鲜贮藏中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验中草莓品种选用‘红颜’（Fragaria ananassaDuch.cv.Benihoppe），于江苏省南京市锁石生态园采摘， 并在采后2 h内运回实验室。采摘草莓的成熟度为七成熟，单果质量约20 g，采摘时排除任何有明显机械损伤或者病害的水果。

丙酮、乙酸、乙醇、H2O2、四氯化钛 国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠、乙酸钠、硫酸、聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通（Triton X-100） 北京索莱宝科技有限公司；MT、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、愈创木酚、水杨酸、盐酸羟胺、二硝基苯甲酸 上海麦格林生化科技有限公司；甲硫氨酸、核黄素、氮蓝四唑 上海瑞永生物科技有限公司；硫酸亚铁 萨恩化学技术（上海）有限公司；硫代巴比妥酸、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、三氯乙酸 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Minolta CR-400色度计 日本柯尼卡美能达传感技术有限公司；14081S手持阿贝折光仪 日本Atago公司；UV-1600型分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；GL-20GH冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂； DK-S26型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司： FA1104电子天平 上海精密科学仪器有限公司； TA-XT2i型质构仪 英国Stable Micro System公司；DRWM型低温人工气候箱 宁波市江南仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 草莓常温保鲜实验

将采摘后的草莓整齐排列在实验台上，散去田间热。将草莓随机分为4 组，分别用蒸馏水（对照）和100、300、500 μmol/L MT浸泡处理5 min，处理后将水果轻放在实验台上，并在室温下晾干。将再将果实分装于透明塑料盒（20 cm×12 cm×8 cm）内，每盒装6 颗草莓，并在塑料盒外套上0.01 mm厚的聚乙烯保鲜袋。在（20±1）℃，相对湿度90%～95%的恒温培养箱中避光贮藏6 d后取样，检查腐烂情况并测定腐烂指数、硬度、可溶性固形物质量分数、ASA含量。每组选用100 个果实，3 次重复。

1.3.2 低温保鲜实验

利用常温保鲜实验的结果筛选出最佳浓度进行低温保鲜实验，分为两组。MT处理组：以常温保鲜实验获得的最佳浓度MT浸泡草莓5 min。对照组：用蒸馏水浸泡草莓5 min。其余实验操作与1.3.1节常温保鲜实验中相同，在（4±1）℃下贮藏12 d，每3 d取样测定腐烂指数，然后用液氮速冻剩余果实，得到冷冻草莓样品，在-80 ℃下保存备用。每组各选用300 个果实，3 次重复。

1.3.3 腐烂指数的测定

参考Aghdam等[7]的方法，将草莓腐烂程度分为5 个等级：0级：无腐烂；1级：腐烂面积占果实表面的1%～20%；2级：腐烂面积占21%～40%；3级：腐烂面积占41%～60%；4级：腐烂面积占61%～80%。根据所取样品腐烂程度的统计结果，统计每组20 个草莓腐烂情况，重复3 次，并按式（1）计算腐烂指数。

1.3.4 硬度与可溶性固形物质量分数的测定

用TA-XT2i型质构仪测定草莓的硬度。测定参数设置：力量感应元50 N、圆柱形探头直径5 mm、触发力0.5 N、下压距离5.0 mm、下压速率2.0 mm/s、测试速率1.0 mm/s、回程速率3.0 mm/s。重复测定10 次，单位为N。

可溶性固形物质量分数用手持阿贝折光仪测定，重复测定10 次。

1.3.5 抗坏血酸含量的测定

ASA含量的测定参考文献[11]。以ASA为标准物质构建标准曲线，单位为 mg/100 g。

1.3.6 丙二醛、H2O2含量与O2

-·生成速率的测定

MDA含量的测定参考文献[12]。称取1 g 由1.3.2节获得的草莓冻样，加入5 mL三氯乙酸提取液研磨匀浆，低温离心（12 000×g、4 ℃，20 min）后得到上清液备用。取2 mL上清液液于玻璃试管，加入2 mL 质量分数0.67%的硫代巴比妥酸溶液，保鲜膜封口，沸水浴20 min后冷却并测定在450、532 nm和600 nm波长处的吸光度A450nm、A532nm、A600nm，按式（2）计算MDA含量，单位为μmol/g。

H2O2含量的测定参照文献[13]的方法，单位为μmol/g。

O2-·生成速率的测定参照文献[14]，单位 为nmol/（min·g）。

1.3.7 活性氧代谢相关酶活力的测定

SOD活力的测定参照文献[15]的方法。以1 min内反应体系在560 nm波长处对氮蓝四唑光化还原的抑制为50%时所需的酶量为1 个活力单位，结果以蛋白质量计，表示为U/mg。

POD活力的测定参照文献[16]，CAT活力的测定参照文献[17]，抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的测定参照文献[18]，结果以蛋白质量计，表示为U/mg。

1.3.8 谷胱甘肽含量的测定

谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的测定参考曹建康等[13]的方法。

1.3.9 自由基清除率的测定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的测定参照文献[19]并稍作修改。将1 g冷冻草莓样品用5 mL 50%乙醇研磨匀浆，然后在低温离心（12 000×g、4 ℃，20 min）后制得上清液备用。取50 μL上清液加入到2.45 μL 1.27×10－4μmol/L的DPPH-乙醇溶液中，混匀后，室温下放置20 min，测定在517 nm波长处的吸光度A样品，空白组以50%乙醇代替样品，测得517 nm处吸光度A空白， 按式（3）计算DPPH自由基清除率。

ABTS阳离子自由基清除率的测定参考文献[20]并稍作修改。ABTS阳离子自由基工作液的配制：将10 mL 8 mmol/L的ABTS与176 μL 158 mmol/L的K2S2O8混合，暗处静置12 h以上，得到ABTS阳离子自由基母液。取1 mL母液，稀释60 倍左右使得400 nm波长处吸光度为0.7～0.9，得到ABTS阳离子自由基工作液，现配现用。取1 g冷冻草莓样品，加入5 mL 95%乙醇研磨匀浆，低温离心后（12 000×g、4 ℃，20 min）取上清液备用。取3 mL ABTS阳离子自由基工作液与0.033 mL上清液混合均匀，在常温下于暗处放置10 min，测定在734 nm波长处的吸光度A样品，空白组以95%乙醇代替样品，测定734 nm处的吸光度A空白，按式（4）计算ABTS阳离子自由基清除率。

羟自由基清除率测定参考文献[21]并稍作修改。取1 g冷冻样品，加5 mL 50%乙醇研磨至匀浆，低温离心（12 000×g、4 ℃，20 min）后取上清液备用。反应体系为1.5 mL 0.18 mol/L的水杨酸-乙醇溶液，2 mL 0.18 mol/L的硫酸亚铁溶液，0.02 mL 0.1% H2O2溶液，上清液0.1 mL。在510 nm波长处测定吸光度A。对照组1以50%乙醇溶液代替上清液得吸光度A0，对照组2以纯乙醇溶液代替硫酸亚铁溶液得吸光度Ax，按式（5）计算羟自由基清除率。

1.4 数据统计与分析

每个指标测定3 个平行样，重复测定3 次。采用Origin 2018进行作图，采用SAS 8.0软件进行单因素方差分析，用Duncan多重比较法进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度MT处理对常温贮藏草莓品质的影响

如表1所示，不同浓度的MT均可以延缓草莓的腐烂，300 μmol/L MT处理的草莓在6 d后的腐烂指数为44.94%，显著低于其他处理组（P＜0.05），比对照组低39.09%。

表1 不同浓度MT处理对常温贮藏6 d的草莓品质指标的影响Table 1 Effects of melatonin at different concentrations on the quality of strawberry stored at 20 ℃ for 6 days

硬度是判断草莓品质的具有代表性的指标之一，且在贮藏期间草莓的硬度会有所下降。如表1所示，不同浓度的MT处理均能延缓其下降，在贮藏6 d后，300 μmol/L MT处理组草莓硬度显著高于其他组（P＜0.05），说明此浓度处理组的贮藏效果最佳。

可溶性固形物含量可以粗略地反映草莓中糖与其他营养物质含量。在贮藏过程中，各浓度的MT处理的草莓中可溶性固形物质量分数均显著高于对照组 （P＜0.05），但各处理组间无明显差异（P＞0.05）。

ASA既是营养物质，又是抗氧化剂，草莓中ASA含量在贮藏期间一般呈先上升后下降的趋势。由表1可知，不同浓度的MT处理草莓中ASA含量高于对照组，其中100、300 μmol/L MT处理组ASA含量显著高于对照组（P＜0.05），且300 μmol/L MT处理组ASA含量最高（P＜0.05）。

因此，综合上述结果可知，300 μmol/L为MT维持草莓品质的最佳浓度，以此浓度处理草莓，进一步验证MT处理对草莓在低温贮藏中的保鲜效果。

2.2 MT对低温贮藏草莓腐烂指数的影响

如图1所示，低温贮藏期间草莓腐烂指数不断上升，到贮藏后期，草莓腐烂速度加快，贮藏12 d时MT处理组腐烂指数为14.66%，而对照组为37.87%，表明MT处理能显著抑制草莓腐烂（P＜0.05），延长草莓的保质期。

图1 MT对草莓腐烂指数的影响Fig.1 Effect of melatonin treatment on decay index of strawberry fruit

2.3 MT对低温贮藏草莓MDA含量、H2O2含量与O2-· 生成速率的影响

MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一，MDA的积累会对果蔬细胞造成氧化损伤，因此其含量能反映细胞膜脂过氧化程度。如图2A所示，草莓在贮藏的12 d内， MDA含量呈现不断上升的趋势，可能是低温贮藏时的冷刺激导致，贮藏6 d后MT能显著地延缓MDA含量的 上升（P＜0.05）。

图2 MT对草莓MDA含量（A）、H2O2含量（B）和·生成 速率（C）的影响Fig.2 Effect of melatonin treatment on MDA content (A), H2O2 content (B) and · production (C) in strawberry fruit

H2O2的积累会使得细胞膜脂质过氧化而产生损害，造成细胞衰老，但也能参与果实抗病性和抗逆性启动的诱导过程。由图2B可知，在整个贮藏期间，草莓中H2O2不断积累。贮藏初期，MT处理组中的H2O2积累速度超过了对照组，但是贮藏12 d后，对照组中的H2O2含量显著高于MT处理组（P＜0.05）。

2.4 MT对低温贮藏草莓ROS代谢相关酶活力的影响

SOD普遍存在于植物体内，能和CAT、POD、APX等酶共同组成植物的抗氧化系统来抵抗ROS造成的损伤。如图3A所示，贮藏期间，草莓中SOD活力呈缓慢下降趋势，且第6 天起，MT处理组草莓SOD活力显著高于对照组（P＜0.05），贮藏12 d时，MT处理组的SOD活力比对照组高5.45%。POD作为ROS代谢中重要的酶存在于 果蔬之中。贮藏期间POD活力呈先上升后下降趋势 （图3B），MT处理促进草莓贮藏前期POD活力的上升，并延缓其贮藏后期活力的下降，贮藏期间MT处理组POD活力显著高于对照组（P＜0.05），在贮藏12 d时，MT处理组的POD活力比对照组高28.75%。如图3C所示，在草莓贮藏前3 d，CAT活力上升，随后持续下降，贮藏6 d后，MT处理组CAT活力显著高于对照组（P＜0.05）。如图3D所示，草莓APX活力在贮藏期间呈先上升后下降趋势，贮藏期间MT处理组APX活力均显著高于对照组（P＜0.05），两组草莓均在贮藏6 d出现峰值，且MT处理组中APX活力峰值是对照组中的1.24 倍。

图3 MT处理对草莓SOD（A）、POD（B）、CAT（C）、 APX（D）活力的影响Fig.3 Effect of melatonin treatment on SOD (A), POD (B), CAT (C) and APX (D) activities in strawberry fruit

2.5 MT对低温贮藏草莓GSH含量和ASA含量的影响

GSH可以在植物代谢循环中作为还原剂，能在脱氢ASA还原酶的作用下将脱氢ASA还原成还原型ASA，而还原型ASA能直接清除H2O2。如图4A所示，草莓GSH含量在贮藏期间先增高后降低，从第6天开始，MT处理组中GSH含量一直显著高于对照组（P＜0.05），贮藏12 d时比对照组高14.42%，说明MT能延缓GSH含量的下降，维持草莓的抗氧化能力。由图4B可知，草莓中ASA含量在贮藏期间先上升后下降，贮藏3 d后，MT处理表现出延缓草莓ASA含量下降的能力，且在9 d后其ASA含量显著高于对照组（P＜0.05）。

图4 MT处理对草莓GSH（A）和ASA（B）含量的影响Fig.4 Effect of melatonin treatment on GSH (A) and ASA (B) contents in strawberry fruit

2.6 MT对低温贮藏草莓自由基清除率的影响

DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率和羟自由基清除率均直观地展现了果实抗氧化能力，自由基清除率越高表示草莓的抗氧化能力越强。图5A中，草莓DPPH自由基清除率先上升迅速后趋于缓慢，从第6天开始，处理组的DPPH自由基清除率就显著高于对照组（P＜0.05），在贮藏末期，MT处理组的DPPH自由基清除率为52.34%，是对照组的1.09 倍。由图5B可知，两组草莓ABTS阳离子自由基清除率逐渐增加，其中对照组由贮藏0 d时的54.87%逐步增长至12 d时的69.56%，而MT处理组在第12天时则为74.73%，且贮藏9、12 d时，MT处理组ABTS阳离子自由基清除率显著高于对照组 （P＜0.05）。如图5C所示，随着草莓贮藏时间的延长，其羟自由基清除率呈现总体上升的趋势，且MT处理组在贮藏6 d时开始显著高于对照组（P＜0.05），至贮藏12 d时，MT处理组的羟自由基清除率是对照组的1.10 倍。由此说明，外源MT能显著增加草莓的自由基清除能力，提升草莓抗氧化能力以维持细胞膜完整性。

图5 MT处理对草莓DPPH自由基清除率（A）、ABTS阳离子 自由基清除率（B）和羟自由基清除率（C）的影响Fig.5 Effect of melatonin treatment on scavenging capacity of strawberry fruit against DPPH radicals (A), ABTS cation radicals (B) and hydroxyl radicals (C)

3 讨 论

由于草莓采后代谢活动尚未停止，衰老与外界胁迫均会促使细胞中过量的自由基引发膜脂质过氧化作用，引起果实品质下降[22-23]。本研究中利用不同浓度的MT处理草莓，在20 ℃贮藏6 d后，300 μmol/L MT可以显著降低草莓腐烂指数，延缓硬度和可溶性固形物质量的下降并维持ASA含量。这与王晶等[24]的报道结果相似，即外源MT能够提升柑橘果实的新鲜度和ASA含量，并提高可溶性固形物含量和果实风味。此外，千春录等[25]发现MT处理后的水蜜桃，其在贮藏过程中的硬度下降、质量损失率上升以及冷害症状均被抑制，从而维持了感官品质。

SOD、CAT、APX、POD 4 种酶均是植物酶促防御系统中主要的代谢酶[27]。本实验探究了在所筛选浓度下，MT对草莓贮藏期间SOD、POD、CAT、APX活力产生的影响，发现MT在贮藏后期对SOD活力的维持效果十分显著，而对POD、CAT和APX的影响则主要体现在提升贮藏前期酶活力并延缓贮藏后期酶活力下降，这可能与H2O2含量因果实受到MT处理而出现迸发有关，即酶促防御系统在贮藏初期受到了诱导强化，而后相对较高的抗氧化酶活力导致贮藏后期中MT处理组相对较低的ROS含量。

ASA与GSH等抗氧化物质在清除ROS的非酶促防御系统中十分重要。ASA与GSH不仅能直接将ROS还原，还可以通过与抗氧化酶类（例如GSH还原酶和脱氢ASA还原酶）共同发挥作用，参与对ROS的清除。本研究发现，贮藏过程中GSH与ASA含量的降低也会被MT延缓，这或许与MT也是一种强抗氧化剂有关，MT可以直接参与自由基清除的过程[28]，从而延缓GSH与ASA的氧化消耗，维持ASA-GSH循环的稳定性与还原能力。自由基的清除速率能直观地展示果蔬的抗氧化能力的变化，本研究发现，与对照组相比，MT对草莓DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率的提升效果十分显著，随着贮藏时间的延长，这种效果愈加明显，这可能与MT对草莓中酶促与非酶促防御系统的促进作用有关，MT对二者的促进作用直接和间接地提高了草莓果实的抗氧化能力，使MT处理组果实清除各自由基的能力均有显著提升。

综上所述，MT增加草莓贮藏期间的抗氧化能力，主要体现在其对草莓酶促防御系统和非酶促防御系统的能力提升上。这与朱玲玲等[29]发现用MT处理降低了青花菜中·和H2O2积累的结果相似，而且SOD、CAT和POD活力也同时增加，表明褪黑激素可以通过调节呼吸代谢和抗氧化活力来延迟西兰花收获后的衰老过程。另外，Hu Wei等[30]发现外源MT可通过降低H2O2含量来提高CAT和POD的活力，显著延迟木薯块根的生理性变质，还通过激活ROS清除和ROS信号转导途径起作用。

4 结 论

本研究通过对MT处理草莓贮藏期间腐烂指数以及品质指标的测定，确定MT对草莓的品质具有维持作用，并筛选获得了300 μmol/L的最佳浓度，然后用300 μmol/L的MT处理草莓并低温贮藏。结果发现，MT处理能降低草莓MDA与H2O2的积累，抑制O2-·生成速率的上升，维持ROS代谢相关酶（SOD、POD、CAT、APX）的活力并延缓GSH与ASA含量的下降，说明MT能增加草莓采后的抗氧化能力，减少氧化损伤，而ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率的提升则更直观地展示了MT对草莓抗氧化能力的提升效果。综上所述，MT处理能降低草莓贮藏期间的腐烂程度，延缓膜脂过氧化，延长保质期。