苦荞中可溶性及不可溶性膳食纤维调控 糖尿病小鼠糖脂代谢的功效

仇 菊，朱 宏，吴伟菁*

（1.农业农村部食物与营养发展研究所，北京 100081；2.厦门医学院公共卫生与医学技术系，福建 厦门 361023）

膳食纤维对人体的健康作用越来越受到关注。我国对正常成年人的膳食纤维每日推荐摄入量为25～35 g[1]，而据统计我国居民的平均摄入量只有11 g[2]，不到推荐量的一半。所以，在日常膳食中非常有必要补充膳食纤维。已有大量研究发现，总膳食纤维的摄入与2型糖尿病的患病风险显著相关，其中谷物膳食纤维降低糖尿病患病风险的作用最为明显，蔬菜其次，水果的膳食纤维与患病风险无明显关联[3-5]。可见，谷物作为膳食纤维的重要来源在平衡膳食营养及预防2型糖尿病中发挥重要作用。

由于不可溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）在谷物中占比较大，多数营养干预研究将谷物膳食纤维等同于IDF。例如，有研究将燕麦膳食纤维作为IDF，与瓜尔豆胶可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）进行对比，发现燕麦IDF比瓜尔豆胶SDF能更有效地改善肥胖小鼠的胰岛素敏感性[6]。然而，燕麦中最受关注的SDF为β-葡聚糖，β-葡聚糖在调控血糖及血脂方面的功效均已获得广泛的认可[7-10]。然而，除了燕麦及大麦[11]中的β-葡聚糖作为SDF受到了较多关注，其他谷物中SDF及IDF功效尚不明确，更缺乏对谷物中SDF及IDF功效比较的研究。

苦荞经证实是一种具有改善血糖、血脂代谢的功能性谷物[12]。大部分研究认为苦荞的功效来自类黄酮[12-13]、D-手性肌醇[14]、蛋白质[15]等，却忽视了苦荞中含量较高的膳食纤维。苦荞中膳食纤维含量（质量分数）约为25.97%[16]，远远高于小麦（11～17 %）[17]、大米（3.24 %）[18]等谷物中膳食纤维的含量。目前，关于苦荞膳食纤维的研究，主要集中在提取工艺及改性上，对其调控血糖的作用仅局限在体外抑制α-D-葡萄糖苷酶活性的作用[19]。虽然，谷物膳食纤维维持糖脂稳态功能的研究已有较多报道，但苦荞膳食纤维的功能活性，特别是体内功效活性却鲜有研究。

因此，本实验从苦荞麸皮粉中分别提取SDF及IDF，通过对比二者对糖尿病小鼠血糖、血脂、肝脏脂肪积累及盲肠中短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的影响，探究不同膳食纤维调控糖脂代谢的功效差异及相关调控机制的异同。本研究不仅为苦荞膳食纤维的调控糖脂代谢功效提供直接科学证据，也为探究谷物SDF及IDF的作用差异提供了思路。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

4 周龄雄性清洁级C57BL/6小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCΧK（沪）2017-005。

‘西荞二号’苦荞麸皮粉，由国家燕麦荞麦产业技术体系凉山综合试验站提供。其中，麸皮质量占全籽粒的37%。

SCFAs标准品、蛋白酶Alcalase 2.4L（活力大于2.4 U/g）、芦丁标准品、链脲佐菌 美国Sigma 公司；淀粉葡萄糖苷酶（100 IU/mg）、耐高温α-淀粉酶（20 000 U/mL） 北京百灵威试剂公司；胰岛素试剂盒 武汉华美生物有限公司；葡萄糖、糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他常用试剂均购自国药集团化学试剂北京有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B气相色谱仪（配有火焰离子化检测器） 日本 岛津公司；ICS-3000离子交换色谱仪（配有脉冲安培检测器） 美国赛默飞世尔公司；ACCU-CHEK Active血糖仪 瑞士Roche公司；Alpha-2-4-LSC真空冷冻干燥机 德国Christ公司；Infinite M200酶标仪 奥地 利Tecan公司； Avanti JΧN-26 离心机 美国贝克曼公司； SΧL-1208马弗炉 上海精宏实验设备有限公司；Kieltec Analysister全自动凯氏定氮仪 美国FOSS仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦荞麸皮粉的组成分析

苦荞麸皮粉中膳食纤维（包括SDF和IDF）质量分数测定采用AOAC方法991.43《膳食纤维的测定方法-酶重量法》；苦荞麸皮粉中的蛋白质量分数测定参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》；脂肪质量分数测定参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》；总淀粉质量分数测定参考GB 5009.9—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》；水分质量分数测定参考GB 5009.3—2016 《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；灰分质量分数测定参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；抗性淀粉质量分数测定采用AOAC方法2002.023《淀粉与植物性基质中的抗性淀粉-酶消化法》；芦丁质量分数参考文献[13]测定。

1.3.2 SDF及IDF提取制备

本实验膳食纤维提取参考AOAC方法991.43，并做适当修改。苦荞麸皮粉于80 ℃、体积分数85%的乙醇溶液中于浸泡1 h，过滤。经60 ℃干燥过夜后，将苦荞麸皮粉与水混合（1∶10，m/V）均匀，加热至95 ℃保持15 min，使得淀粉糊化。加入耐高温α-淀粉酶（1∶500，V/V） 水解淀粉，95 ℃保持30 min，直至碘反应显色为阴性。冷却至60 ℃后，将pH值调节为7.5，再加入碱性蛋白酶（1∶500，V/V），于60 ℃反应4 h，除去蛋白质。用盐酸调pH值为4.5，并加入淀粉葡萄糖苷酶，于55 ℃反应2 h，将淀粉水解产物进一步水解。水解结束后，将混合液pH值调至7.0，加热至80 ℃反应10 min以灭酶。混合物于5 500 r/min离心20 min，分别收集上清液和沉淀，获得的沉淀即为IDF。IDF依次采用蒸馏水、无水乙醇及丙酮进一步洗涤、离心（5 500 r/min、10 min），收集沉淀获得洗涤后的IDF。上清液加入4 倍体积预热至60 ℃的无水乙醇，并于室温沉淀1 h。离心（5 500 r/min、10 min）收集沉淀，随后采用无水乙醇和丙酮洗涤沉淀、离心（5 500 r/min、10 min），收集沉淀获得SDF。SDF及IDF分别进行真空冷冻干燥。

1.3.3 膳食纤维单糖组成测定

参考文献[20]，采用离子交换色谱仪，配Carbo PacTMPA20分析柱（3×150 mm，6 μm），测定膳食纤维的单糖组成。

1.3.4 葡萄糖结合能力测定

体外葡萄糖结合测定实验参考文献方法[21]。将1 g的膳食纤维样品加入10 mL不同浓度的葡萄糖溶液中，于37 ℃水浴水平振荡6 h后，离心（4 000×g、20 min），取上清液测定葡萄糖浓度。上清液的葡萄糖浓度采用葡萄糖试剂盒进行测定。葡萄糖结合能力根据公式（1）计算。

1.3.5 糖尿病模型的建立及实验设计

标准鼠维持饲料购自于北京华阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠适应喂养1 周（温度（23±1）℃、相对湿度（60±5）%、12 h/12 h的昼夜交替）。随机抽取9 只小鼠作为健康组，饲喂标准鼠维持饲料。其余小鼠的处理参考文献[22]，建立糖尿病模型。糖尿病模型组先通过饲喂高脂饲料（如表1所示，高脂饲料中脂肪供能比为45%）5 周后，禁食16 h，腹腔注射链脲佐菌素 120 mg/kg后，继续禁食2 h。注射链脲佐菌素后第1周及第2周分别测定空腹血糖浓度，选取连续2 周空腹血糖均超过11.1 mmol/L的小鼠纳入糖尿病模型组。糖尿病模型小鼠分为4 个组（9 只/组），分别为糖尿病组、1% SDF组、1% IDF组、5% IDF组。各组饲料组成如表1所示，饲喂8 周，期间小鼠自由摄入饲料与饮用水。每周记录小鼠的体质量、饲料摄入量及饮水量。

表1 饲料配方和热量密度Table 1 Composition and energy density of experimental diets used in this study g/kg

1.3.6 空腹血糖浓度的测定及口服葡萄糖耐受实验

干预期内空腹血糖浓度（禁食16 h）在尾部采血后通过血糖仪测定。口服葡萄糖耐受实验在干预期最后1 d进行，禁食16 h后，实验动物灌胃2 g/kg（以体质量计）的葡萄糖溶液，尾部采血后采用葡萄糖试剂盒测定0、0.5、1.0、1.5、2.0 h的血糖水平。血糖曲线下面积（area under curve，AUC）采用公式（2）进行计算。

式中：BG0、BG0.5、BG1、BG1.5、BG2为灌胃葡萄糖溶液后0、0.5、1.0、1.5、2.0 h的血糖浓度/（mmol/L）。

1.3.7 血清及肝脏生化指标的测定

小鼠在禁食16 h后用异氟烷麻醉后，血液样本由眼眶采血，并于室温凝固离心后得血清。获取小鼠肝脏与预冷的生理盐水按1∶9（m/V）混合并于冰上均质，获得肝脏均质液。血清及均质液中生化指标（胰岛素、GSP、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST水平）均采用试剂盒法测定。

1.3.8 短链脂肪酸的测定

取小鼠盲肠内容物，加入5 倍体积的硫酸酸化的超纯水（pH 2.0）于4 ℃提取30 min。4 ℃离心（6 000 r/min、15 min）后，精确量取0.5 mL上清液，加入0.5 mL的乙醚，充分漩涡混匀后离心（6000 r/min、10 min），收集乙醚层后，用0.22 μm的滤膜过滤后进行气相色谱检测。进样量为1 μL。色谱温度程序：初始温度100 ℃；6 ℃/min 升温至170 ℃；20 ℃/min升温直至230 ℃，并保持2 min。进样口温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃。配制SCFAs标准液（质量浓度0.1～2 mg/mL）进行定量分析。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 24.0进行统计分析。实验数据用平均值±标 准差表示。多组之间比较采用单因素方差分析，事后比较采用Duncan分析。P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 苦荞麸皮组成及其膳食纤维单糖组成

如表2所示，苦荞麸皮中含有丰富的蛋白质、抗性淀粉及膳食纤维。苦荞麸皮中总膳食纤维质量分数为23.54%，其中IDF的质量分数为19.52%，约为SDF质量分数（4.02%）的5 倍。苦荞膳食纤维中单糖组成分析结果显示，苦荞SDF中单糖组成(质量分数)分别为：53.56%葡萄糖、21.22%半乳糖、8.26%阿拉伯糖、6.47%甘露糖、5.74%木糖、4.76%鼠李糖；苦荞IDF中的单糖组成(质量分数)分别为：46.65%葡萄糖、21.36%阿拉伯糖、10.42%半乳糖，9.48%木糖、5.87%鼠李糖、5.18%半乳糖糖醛酸、1.04%葡萄糖醛酸。

表2 苦荞麸皮粉的主要成分和质量分数Table 2 Major composition of tartary buckwheat bran

2.2 苦荞SDF及IDF的葡萄糖结合能力

在不同浓度的葡萄糖溶液中，苦荞SDF及IDF均表现出葡萄糖结合能力，在各浓度梯度上，二者结合能力 无显著差异（P＞0.05）（表3）。随着葡萄糖溶液的浓度从10 mmol/L升高至200 mmol/L，与SDF及IDF结合的葡萄糖分别为11.39～2 070.64、12.01～1 913.19 μmol/g。

表3 不同浓度的葡萄糖溶液中苦荞SDF及IDF的葡萄糖结合能力Table 3 Glucose binding capacities of SDF and IDF from tartary buckwheat at different concentrations of glucose

2.3 苦荞SDF及IDF对糖尿病小鼠血糖、血清GSP水平的影响

糖尿病组小鼠的空腹血糖水平及血清中GSP浓度均显著高于健康组小鼠（P＜0.05），而经过8 周干预后，苦荞SDF及IDF干预显著降低了糖尿病小鼠的空腹血糖水平（P＜0.05）（表4）。但1% SDF与1% IDF及5% IDF组间的空腹血糖水平无显著差异（P＞0.05）。GSP浓度可反映1～2 周内机体的平均血糖的水平，不受临时血糖浓度波动的影响，可反映较长时间的血糖控制水平。其检测结果发现，SDF及IDF干预均显著降低了糖尿病小鼠的GSP浓度（P＜0.05），而且5% IDF组的GSP水平显著低于1% SDF及1% IDF组（P＜0.05）。虽然，SDF及IDF在干预期内降低空腹血糖的作用无显著差异（P＞0.05），但5% IDF对GSP浓度的控制效果则更明显。

表4 膳食干预后糖尿病小鼠空腹血糖及GSP浓度的变化Table 4 Changes in fasting blood glucose and glycosylated serum protein (GSP) levels in diabetic mice during dietary intervention

如图1A所示，口服葡萄糖耐量实验中，与糖尿病组相比，1% SDF及5% IDF在0～2 h内能够降低血糖水平，而1% IDF对血糖的控制效果不明显，与糖尿病组无显著性差异（0.5 h及2 h，P＞0.05）。如图1B所示，经过SDF及IDF干预后，AUC显著低于糖尿病组（P＜0.05），但不同剂量组间无显著差异。如图1C所示，经过1% SDF及5% IDF干预后，糖尿病小鼠的血清胰岛素水平显著上升，而1% IDF对胰岛素水平无显著改善作用。上述结果表明，1% IDF控制血糖上升的作用没有1% SDF强，但当IDF剂量达到5%时，其控制餐后血糖上升的作用与1% SDF无明显差别。

图1 膳食纤维对糖尿病小鼠血糖代谢的影响Fig.1 Effect of dietary fiber on glucose metabolism in diabetic mice

2.4 苦荞SDF及IDF对糖尿病小鼠血脂代谢的影响

如图2所示，与糖尿病组相比，苦荞SDF及IDF均能够显著降低糖尿病小鼠的血清TC及LDL-C水平 （P＜0.05），且1% SDF、1% IDF对控制TC和LDL-C水平的效果无显著差异（P＞0.05），但5% IDF比1% SDF及1% IDF更显著地降低了TC和LDL-C水平 （P＜0.05）。SDF及IDF对于TG及HDL-C水平无显著影响（P＞0.05）。上述结果表明，在降低血清TC及LDL-C水平上，1% IDF与1%的SDF效果相当，但5% IDF效果更强。

图2 膳食纤维对糖尿病小鼠血脂代谢的影响Fig.2 Effect of dietary fiber on serum lipid profile of diabetic mice

2.5 苦荞SDF及IDF对糖尿病小鼠肝脏脂质代谢及肝功能的影响

如图3所示，与糖尿病组相比，1% SDF能够显著降低肝脏TC、TG水平（P＜0.05），而1% IDF无显著性降低TC及TG水平的作用（P＞0.05）；SDF及IDF均能够显著降低血清ALT水平（P＜0.05），1% IDF及5% IDF对血清ALT水平影响无显著差异（P＞0.05）。1% SDF降低血清ALT水平的作用显著高于1% IDF（P＜0.05），而与5% IDF无显著差异（P＞0.05）。SDF及IDF均对血清中AST活力无显著影响（P＞0.05）（图3D）。上述结果表明，1% IDF对肝脏脂质无明显改善作用，5% IDF降低肝脏TC、ALT水平的作用与1% SDF效果相近，但在降低肝脏TG水平方面，1% SDF效果更强。

图3 膳食纤维对糖尿病小鼠肝脏脂肪组成及肝功能的影响Fig.3 Effect of dietary fiber on hepatic lipid profile and function parameters of diabetic mice

2.6 苦荞SDF及IDF对糖尿病小鼠盲肠中SCFAs质量浓度的影响

如图4所示，苦荞SDF及IDF干预能够显著提高糖尿病小鼠盲肠中的乙酸质量浓度（P＜0.05）。1% SDF及5% IDF均能够显著提高糖尿病小鼠盲肠中的丙酸及丁酸质量浓度（P＜0.05），但1% IDF对提高糖尿病小鼠盲肠中丙酸及丁酸质量浓度无影响。由此可见，IDF提高盲肠中SCFAs水平的效果与剂量紧密相关，1% SDF与5% IDF对盲肠中SCFAs质量浓度的影响相同。

图4 膳食纤维对糖尿病小鼠盲肠中SCFAs质量浓度的影响Fig.4 Effect of dietary fiber on caecal SCFAs in diabetic mice

3 讨 论

多数研究将IDF作为谷物膳食纤维的代表来解释谷物膳食纤维降低2型糖尿病患病风险的作用[3-4]，却忽视了谷物中并存的SDF与IDF的作用贡献差异。有研究认为IDF与SDF不同，SDF通过发酵促进肠道有益菌生长，并产生SCFAs改善肠道健康从而发挥调控糖脂代谢等作用[23]， 而IDF更多是通过促进肠道蠕动来发挥作用[24]。食物中的SDF及IDF作用也逐步受到关注，然而，谷物中IDF的含量远大于SDF，因此，比较其二者功效时，需考虑其在谷物中的原始比例。本研究测定苦荞麸皮中IDF含量约为SDF的5 倍。因此，在比较SDF及IDF在同等剂量下（1%）功效外，按照苦荞原料中的比例，比较1% SDF及5% IDF干预对糖尿病小鼠糖脂代谢的影响，旨在研究在苦荞食品真实体系下，SDF及IDF作用贡献。

本研究的体内、体外实验发现，苦荞SDF及IDF具有一定的调节血糖的作用。体外葡萄糖结合能力结果未发现二者在相同浓度下的差异，但根据以往研究来看，不同来源IDF的葡萄糖结合能力各异，大米IDF在5～200 mmol/L葡萄糖溶液中的结合能力为 10～1 040 μmol/g[25]；燕麦IDF在100 mmol/L葡萄糖溶液中的结合能力为430 μmol/g[26]，相比之下，苦荞SDF及IDF的葡萄糖结合能力较高。膳食纤维可能通过结合葡萄糖延缓餐后血糖升高[21]。进一步的血糖研究结果也发现，苦荞SDF及IDF在糖尿病小鼠体内降低空腹血糖的作用无显著差异，但对GSP水平的控制效果则是5% IDF更显著。这说明，IDF对血糖的调控存在剂量依赖性。随后的口服葡萄糖耐受实验也发现了同样的结果，1% IDF控制血糖上升的作用比1% SDF弱。这一发现与以往对比SDF及IDF的研究结果一致：在同等剂量下，脱脂小茴香SDF比IDF具有更显著降低血糖作用[23]。另外研究还发现，5% IDF的调控血糖的效果与1% SDF相同，说明虽然同等剂量下IDF作用较弱，但是由于IDF在谷物中占比大，它能与SDF一样调控血糖代谢。在接下来的研究中发现，苦荞IDF提高盲肠中SCFAs水平的效果也与剂量紧密相关，1% SDF与5% IDF对盲肠中SCFAs的含量具有相同作用，而1% IDF对丙酸和丁酸的产生无促进作用。膳食纤维通过发酵促进肠道菌群生长并提高SCFAs的作用已有较多报道。SDF可显著提高盲肠中SCFAs含量，例如，低聚果糖、β-葡聚糖、苹果果胶[27]、瓜尔胶[6]、脱脂小茴香的SDF[23]等，但纤维素无相关作用[27]。研究表明，膳食纤维发酵后产生SCFAs可能参与血糖调控，这与改善胰岛素抵抗、改善炎症、促进β胰岛细胞增殖及抑制凋亡、增加GLP-1分泌等机制有关[28-30]。

在调控脂质代谢方面，苦荞膳食纤维也呈现出剂量依赖效应。5% IDF能够比1% IDF及1% SDF更显著降低血清TC及LDL-C水平，且5% IDF降低肝脏TC、ALT水平的作用与1% SDF效果相同。已有研究报道，SDF（7%瓜尔胶[31]及2%、4%大麦β-葡聚糖[32]）对模型鼠的血清TC、TG水平无影响。但大麦β-葡聚糖可以有效降低高脂诱导肥胖小鼠的肝脏TG及TC水平。膳食中添加甲基纤维素及车前草壳纤维等IDF能够降低高脂诱导肥胖大鼠的血清TG及TC，而纤维素无该作用[33]。另外，10%燕麦IDF能够比瓜尔胶（一种SDF）更显著降低高脂诱导肥胖小鼠肝脏的TG积累，其机理与肝脏中脂肪代谢相关酶的活力增加有关[6]。这些研究说明不同来源的SDF及IDF调控脂质代谢的效果存在差异。谷物膳食纤维能够降低血脂及肝脏脂肪积累已有科学证据，其作用机制可能是通过调控脂肪代谢相关基因FAS[32-33]及胆固醇相关基因CYP7A1[32]，促使脂肪分解转化生成SCFAs。由此可见，苦荞SDF和IDF均能够通过促进SCFAs生成，改善糖尿病小鼠的脂质代谢。

综上所述，SDF及IDF干预均能够降低糖尿病小鼠的空腹血糖，相同剂量下SDF能够比IDF更有效的发挥降血糖作用，但当IDF剂量为SDF的5 倍时，即苦荞麸皮中的原始比例，IDF降低血清TC及LDL-C水平的作用比SDF更佳。1% SDF及5%的IDF具有同样的提高盲肠中SCFAs水平的效果。本研究揭示了苦荞SDF及IDF在维持血糖及血脂稳态作用的量效关系上的差异，以及通过促进胰岛素分泌改善糖耐量、通过促进SCFAs排出改善脂质代谢等相关作用机制方面的异同，为充分理解谷物中SDF和IDF的糖脂调控功效提供了科学证据。