解郁养肝汤对抑郁大鼠海马及血清IL-1β、IL-6的影响

林 海，何坤达，王显著，田 兵，宿长军

抑郁症所致疲乏属中医学“郁病”“虚劳”范畴。抑郁症是一种以持续性心境低落为主要特征的情绪障碍综合征，具有慢性、易复发的特点。疲乏是抑郁症的核心症状之一[1]，主要临床表现为缺乏动力和能量、感觉身体活动缓慢等，疲乏相关症状严重影响病人生活及工作能力。疲乏也是抑郁症的残留症状之一[1]，相关研究显示，经过14周的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSR1)治疗后，约60.8%的病人存在疲乏的残留症状[2]。本研究观察解郁养肝汤对应激性抑郁大鼠海马及血清炎性因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)表达水平的影响，探讨抑郁症疲乏的可能机制及解郁养肝汤抗抑郁、解除疲乏症状的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SpragueDawley(SD)成年雌性大鼠140只，体重180～220 g，购自西安交通大学动物实验中心，陕西中医药中心实验室饲养。本研究获得陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验药物 解郁养肝汤由西安市中医医院药剂科制成浸膏，每克浸膏相当于含原生药5 g，4 ℃保存。盐酸氟西汀(礼来苏州制药有限公司生产，规格：每粒20 mg，批准文号：9701B，由西安市中医医院药剂科提供)研钵粉碎，溶于适量蒸馏水制成悬液，4 ℃保存。

1.3 实验仪器 超净工作台(苏州净化设备产品)；电子精密天平(上海精密科学仪器有限公司，型号：FA1004N)；水平离心机(LD-42型，北京医用离心机厂生产)；DK-8A型电恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司)；A0-800病理切片机(上海医疗器械厂生产)；OLYMPUS全自动显微镜照相装置(PM-10AD型，日产)；冰箱(西门子公司)等。

1.4 模型制备 实验前先进行1%的蔗糖水训练3 d，改变大鼠之前的饮水习惯。第4天禁水24 h后，行糖水偏好实验12 h，计算12 h内大鼠糖水饮用量，根据测量结果和体重随机分为空白对照组、模型组、氟西汀组、解郁颗粒组、解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组，每组20只。除空白对照组，其余各组通过慢性不可预知应激刺激与孤养相结合方法制造抑郁模型。所有大鼠独笼饲养，在21 d内随机每日给予一种刺激，同一种刺激不能连续出现，使动物不能预知给予的应激。

1.5 大鼠行为学观察 于实验第22天、第43天分别测定各组大鼠跑台有氧力竭运动、悬尾实验和爬杆时间。跑台实验：根据Bed-ford大鼠体重摄氧量建立回归方程渐增负荷运动模型，行为特征为呼吸急深及幅度大、腹卧位、垂头、刺激后无反应。悬尾实验：将各组大鼠尾端1 cm部位粘贴于一水平木板上，木板离地10 cm以上，大鼠呈倒挂状；悬尾两侧用板隔开大鼠视线为克服不正常体位而挣扎活动，活动一段时间后，出现间隔性“不动”显示“疲劳、失望”状态，计算6～8 min内“不动时间”，并同时观察大鼠挣扎幅度及抑郁状态。爬杆实验：将各组大鼠放于长25 cm，直径1 cm的光滑有机玻璃棒上，使其肌肉处于紧张状态，第3次落水时终止实验，累计3次大鼠从玻璃棒跌落时间。

1.6 各组大鼠海马及血清炎性因子IL-1β、IL-6表达测定 第43天时大鼠经常规麻醉，心脏灌洗，断头取脑，多聚甲醛固定，之后剥离脑组织取海马组织，置于4%的多聚甲醛溶液固定48 h以上，经常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋固定制成蜡块，连续冠状切片，厚度为5μm，免疫组化法检测大鼠海马神经元IL-1β、IL-6阳性细胞数量。将大鼠经常规麻醉，心脏灌洗后，从大鼠股动脉取血3mL，混匀，室温放置15min，3 500 r/min离心10 min，分离血清，置于4 ℃冰箱保存，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-1β、IL-6含量。

2 结 果

2.1 实验完成情况 实验过程中，模型组、氟西汀组、解郁颗粒组、解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组各死亡2只，空白对照组死亡1只，解剖无特殊发现，死亡原因不明。最后纳入统计分析的大鼠共127只，空白对照组19只，模型组、氟西汀组、解郁颗粒组、解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组各18只。

2.2 各组大鼠跑台有氧力竭运动比较 实验第22天，各造模组大鼠通过第一级、第二级负荷及第三级负荷力竭前总时长较空白对照组缩短(P<0.01)。实验第43天，氟西汀组、解郁颗粒组、解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组大鼠通过第一级、第二级负荷及第三级负荷力竭前总时长较模型组延长(P<0.05或P<0.01)；解郁养肝汤高剂量组和解郁养肝汤中剂量组大鼠通过第一级、第二级负荷及第三级负荷力竭前总时长较氟西汀组延长(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠跑台有氧力竭运动比较(±s) 单位：s

2.3 各组大鼠悬尾实验中静止时间比较 实验第22天，各造模组大鼠悬尾实验中静止时间总时长较空白对照组延长(P<0.01)。实验第43天，氟西汀组、解郁颗粒组、解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组大鼠悬尾实验中静止时间总时长较模型组缩短(P<0.05或P<0.01)；解郁养肝汤高剂量组和解郁养肝汤中剂量组大鼠悬尾实验中静止时间总时长较氟西汀组缩短(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠悬尾实验中静止时间比较(±s) 单位：s

2.4 各组大鼠爬杆时间比较 实验第22天，各造模组大鼠爬杆总时长较空白对照组缩短(P<0.01)。实验第43天，氟西汀组、解郁颗粒组、解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组大鼠爬杆总时长较模型组延长(P<0.05或P<0.01)；解郁养肝汤高剂量组和解郁养肝汤中剂量组大鼠爬杆总时长较氟西汀组延长(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠爬杆时间比较(±s) 单位：s

2.5 各组大鼠海马神经元IL-1β、IL-6阳性细胞数量比较 实验第43天，各组大鼠海马CA区均有IL-1β、IL-6表达。氟西汀组、解郁颗粒组、解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组大鼠海马神经元IL-1β、IL-6阳性细胞数量较模型组减少(P<0.05)；解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组与氟西汀组、解郁颗粒组大鼠海马比较，IL-1β和IL-6阳性细胞数量下降(P<0.05或P<0.01)。详见表4、图1及图2。

表4 各组大鼠海马神经元IL-1β、IL-6阳性细胞数量比较(±s)

图1 各组大鼠海马神经元IL-1β阳性细胞数量比较(免疫组化，×200)

图2 各组大鼠海马神经元IL-6阳性细胞数量比较(免疫组化，×300)

2.6 各组大鼠血清IL-1β、IL-6含量比较 实验第43天，各组大鼠血清均有IL-1β、IL-6表达。氟西汀组、解郁颗粒组、解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6含量较模型组降低(P<0.05)；解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组与氟西汀组、解郁颗粒组比较，血清IL-1β和IL-6含量下降(P<0.05或P<0.01)。详见表5。

表5 各组大鼠血清IL-1β、IL-6含量比较(±s)

3 讨 论

慢性轻度不可预见性的应激抑郁模型(CUMS)是抑郁症常用的经典实验模型。本研究在此模型基础上改进，采用慢性轻度不可预知应激抑郁模型加孤养，使得抑郁模型更稳定和科学。造模21 d内随机选取多种不同的应激因素刺激大鼠，使得大鼠不能预料刺激的发生，造成孤养动物抑郁状态。本研究在有限条件下，采用大鼠模型模拟人类抑郁症的临床表现和病理变化[3]，对研究抑郁症发病机制和药物治疗具有重要的指导意义。解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组大鼠通过第一级、第二级负荷及第三级负荷力竭前用总时长较模型组延长(P<0.05或P<0.01)，爬杆总时长较模型组延长(P<0.01)，悬尾实验中静止时间总时长较氟西汀组、解郁颗粒组减小(P<0.01)。表明解郁养肝汤可改善抑郁模型实验大鼠抑郁状态和疲乏症状。

抑郁症病人存在免疫系统异常，在免疫应答中发挥重要作用外，同时介导了一系列类似抑郁的行为和情感障碍。其中炎性因子IL-1β和IL-6生成增多与抑郁症关系密切，IL-1β和IL-6是抑郁症的特异性指标[4]。有研究显示，抑郁症病人体内常存在较高水平的炎性因子，炎性因子导致多种神经精神症状，其中包括抑郁症发作[5]。有研究显示，慢性不可预见应激诱导大鼠出现抑郁样行为同时大鼠海马和血浆IL-1β、IL-6水平明显升高[6]。中枢神经系统在疲劳感知中发挥着重要作用，中枢神经系统处理和重视感官信息，引导动机行为包括决定停止活动或投入努力。慢性疲劳综合征病人普遍存在白质损伤及脑萎缩(海马、纹状体、丘脑、顶叶和额叶等)[7]，提示这些区域损伤可能是疲乏产生的关键，上述部位已证实是细胞因子作用的靶点[8]。细胞因子认为是诱导中枢疲劳的重要介质，其中IL-1β、IL-6多数残留在内部细胞，在外周血液循环与其他细胞结合蛋白质，如2型IL-1受体(IL-1R2)、IL-6受体，其充当诱饵受体，导致生物活性降低[9]。外周产生的IL-1β、IL-6通过多条途径到达中枢神经系统，一旦到达中枢，其在中枢浓度增加影响神经递质系统(如多巴胺和5-羟色胺)，从而对抑郁和疲劳的发展产生影响[10-11]。

目前，抑郁症及抑郁症病人出现疲乏发病机制尚未完全明确，存在许多假说。本研究结果显示，解郁养肝汤高剂量组、解郁养肝汤中剂量组和解郁养肝汤低剂量组与氟西汀组、解郁颗粒组比较，血清IL-1β、IL-6含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。推测本研究使用的解郁养肝汤缓解大鼠疲乏机制可能通过下调机体炎性因子IL-1β、IL-6表达实现的。解郁养肝汤可能在改善抑郁同时对解除疲乏发挥促进作用。