外周血miR-34a、SIRT1水平与脑梗死后认知功能障碍的关系

朱艳玲，孙 强，郝文莉，刘晓琳

脑梗死是临床常见的心脑血管疾病，好发于高龄人群，是由于脑部血液供应障碍、缺氧缺血引起局限性脑组织脑软化或缺血性坏死疾病，导致病人头痛、耳鸣、眩晕、半身不遂等症状[1-2]。有研究显示，15%～50%的脑梗死病人并发认知功能障碍，随着老龄化社会的到来，脑梗死后认知功能障碍病人不断增加，严重影响病人及家庭的正常生活[3]。微小RNA(microRNA)是不具备编码功能的小分子RNA，通过调控靶基因表达参与调控细胞功能[4]。有研究表明，沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是miR-34a作用的靶基因之一，二者在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用[5]。相关研究显示，miR-34a参与慢性脑功能障碍疾病的发生发展，SIRT可发挥神经保护作用，抑制大鼠脑缺血再灌注损伤[6-7]。关于二者在脑梗死后认知功能障碍中作用的研究较少。本研究检测脑梗死病人外周血miR-34a、SIRT1水平，探讨二者与认知功能障碍的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年9月—2019年11月我院收治的脑梗死后认知功能障碍病人145例作为研究对象(观察组)，同期脑梗死未发生认知功能障碍病人145例作为对照组。收集病人一般资料，包括性别、年龄、体质指数(body mass index，BMI)。

1.1.1 纳入标准 符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[8]诊断标准，并经实验室、影像学或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等检查证实；病人及家属知情并签署知情同意书；本研究经过医院伦理委员会审批，符合相关伦理学规定。

1.1.2 排除标准 合并心、肝、肾等重要脏器功能障碍、颅内感染、癫痫等其他影响实验指标的疾病；既往有精神障碍史、认知功能障碍史、抑郁史；理解能力差或有视觉障碍、严重失语、听力障碍等不能配合完成各项评分测评；妊娠期、哺乳期女性；临床资料不完善。

1.2 试剂与仪器 TRIzol试剂(货号：QN2070-ZOG)购自北京百奥莱博科技有限公司；逆转录试剂盒(货号：BPI01030)购自北京华大蛋白质研发中心有限公司；实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒(货号：DEM202-50T)购自北京拜尔迪生物技术有限公司；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500)购自美国Applied Biosystems公司；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 血清miR-34a、SIRT1水平检测 于病人入院后次日清晨抽取空腹外周静脉血5 mL，分离血清。使用TRIzol试剂提取血清总RNA，紫外分光光度计测量RNA质量，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，检验合成cDNA质量。采用qRT-PCR法检测血清miR-34a、SIRT1水平，以U6、GAPDH作为内参基因。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循环40次。miR-34a正向引物：5′-TGGCAGTGTCTTAGCT-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；SIRT1正向引物：5′-CCCAGAACATAGACACGCTGGA-3′，反向引物：5′-ATCAGCTGGGCACCTAGGACA-3′；内参U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；内参GAPDH正向引物：5′-GATTCCACCCATGGCAAATTC-3′，反向引物：5′-AGCATCGCCCCACTTGATT-3′。采用2-ΔΔCt法计算血清miR-34a、SIRT1相对表达量。

1.4 认知功能评定标准 采用简易智能精神状态检查量表(Simple Mental State Examination Scale，MMSE)评分、蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment Scale，MoCA)评定病人认知功能。MMSE评分总分为30分，27～30分为认知功能正常，21～26分为轻度认知功能障碍，10～20分为中度认知功能障碍，0～9分为重度认知功能障碍。MoCA评分总分为30分，27～30分为认知功能正常，≤26分为认知功能障碍。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 两组性别、年龄、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。详见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组血清miR-34a、SIRT1表达水平比较 与对照组比较，观察组血清miR-34a水平升高(P<0.01)，血清SIRT1水平降低(P<0.01)。详见表2。

表2 两组血清miR-34a、SIRT1水平比较(±s)

2.3 两组MMSE评分、MoCA评分比较 与对照组比较，观察组MMSE评分、MoCA评分降低(P<0.01)。详见表3。

表3 两组MMSE评分、MoCA评分比较(±s) 单位：分

2.4 影响脑梗死病人发生认知功能障碍的多因素分析 将脑梗死病人是否发生认知功能障碍作为因变量，以血清miR-34a、SIRT1水平为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，血清miR-34a水平是影响脑梗死病人发生认知功能障碍的独立危险因素(P<0.05)，血清SIRT1水平是影响脑梗死病人发生认知功能障碍的保护因素(P<0.05)。详见表4。

表4 影响脑梗死病人发生认知功能障碍的多因素分析

2.5 脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a、SIRT1水平与MMSE评分、MoCA评分的相关性分析 相关性分析结果显示，脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a水平与MMSE评分、MoCA评分呈负相关(r值分别为-0.427、-0.441，P<0.05)；血清SIRT1水平与MMSE评分、MoCA评分呈正相关(r值分别为0.467、0.458，P<0.05)。详见图1～图4。

图1 脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a水平与MMSE评分的相关性分析散点图

图2 脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a水平与MoCA评分的相关性分析散点图

图3 脑梗死后认知功能障碍病人血清SIRT1水平与MMSE评分的相关性分析散点图

图4 脑梗死后认知功能障碍病人血清SIRT1水平与MoCA评分的相关性分析散点图

2.6 脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a水平与SIRT1水平的相关性分析 相关性分析结果显示，脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a水平与SIRT1水平呈负相关(r=-0.500，P<0.05)。详见图5。

图5 脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a水平与SIRT1水平的相关性分析散点图

3 讨 论

脑梗死是一种致残率、死亡率较高的脑血管疾病，近年来随着生活节奏加快及个人不良生活习惯导致病人发病率呈上升趋势[1]。脑梗死发病机制复杂且具有突发性，易出现局部脑组织血液循环障碍，发生缺血缺氧性损伤及炎症反应增强，造成脑部认知功能区域组织损伤，导致认知功能障碍发生[9]。MMSE评分、MoCA评分是临床评定认知功能障碍的常用方法，两者主要用于评估已发生认知功能障碍、病情较稳定的病人，脑梗死认知功能障碍早期筛查具有一定的局限性[10]。目前，脑梗死认知功能障碍早期筛查的特异性血液生化指标未统一，寻找与脑梗死认知功能障碍发生有关的指标，对临床筛查疾病、预后评估具有重要意义。

miRNAs通过与靶基因非转录区域结合而降解或抑制mRNA表达，抑制靶基因表达，进而参与多种疾病的发生发展过程。姚宝珍等[6]研究表明，颞叶癫痫大鼠模型海马中miR-34a表达水平上调，可能通过激活Notch1信号通路，导致神经元凋亡及神经胶质增多，进而参与癫痫的发生发展。本研究结果显示，脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a水平较未发生认知功能障碍脑梗死病人显著升高，提示miR-34a可能与脑梗死病人发生认知功能障碍过程有关。

SIRT1是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，在神经领域有广泛研究，在神经损伤模型及记忆方面具有保护神经的作用[11]。邓青山等[12]研究显示，高压氧治疗通过增加SIRT1蛋白表达减轻β-淀粉样蛋白对阿尔茨海默病小鼠的神经毒性损伤，改善学习记忆功能，发挥神经保护作用。赵忠惠等[13]研究表明，白藜芦醇通过促进SIRT1表达抑制炎症反应，发挥对蛛网膜下腔出血大鼠中枢神经系统保护作用。本研究结果显示，脑梗死后认知功能障碍病人血清SIRT1水平较未发生认知功能障碍脑梗死病人显著降低，提示脑梗死病人发生认知功能障碍可能与SIRT1表达不足有关。

本研究多因素回归分析结果显示，血清miR-34a水平是影响脑梗死病人发生认知功能障碍的独立危险因素，血清SIRT1水平是保护因素，提示血清miR-34a水平升高、SIRT1水平降低可能增加脑梗死病人发生认知功能障碍的概率。相关性分析结果显示，脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a水平与MMSE评分、MoCA评分均呈负相关，血清SIRT1水平与MMSE评分、MoCA评分均呈正相关，提示血清miR-34a、SIRT1水平与脑梗死后认知功能障碍病人认知障碍程度密切相关。刘晓虹等[14]研究显示，miR-34a通过靶向调节SIRT1表达，实现对高糖条件下骨髓间充质干细胞衰老的调控。马璐等[15]研究表明，miR-34a水平升高后下调其靶蛋白SIRT1的表达，可能与内皮祖细胞功能障碍发生相关。本研究进一步分析结果显示，脑梗死后认知功能障碍病人血清miR-34a水平与SIRT1水平呈负相关，提示miR-34a和SIRT1与脑梗死后认知功能障碍病人发生过程关系密切，可能为靶向调节关系，仍需进一步研究验证。

综上所述，脑梗死后认知功能障碍病人外周血miR-34a、SIRT1水平均异常表达，可能共同调控脑梗死病人认知功能障碍发生，但二者的具体作用机制及相互关系需进一步研究。