HPLC法测定市售白酒中的甲醛含量

胡 杨，李先芝，2，刘 洋，林 露，石 豪，毛琼丽，严 玲

（1.劲牌有限公司，湖北大冶 435112；2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶 435112）

甲醛是一种具有刺激性气味的细胞原生质毒物，作为一种代谢成分普遍存在于生物体中，通过破坏生物体中的蛋白质和酶，使得组织细胞产生不可逆的损伤。早有研究发现，长期处于甲醛环境中会对人体机能造成影响，比如呕吐、腹痛、诱发哮喘[1]、急性炎症[2]、呼吸道损伤[3]、白血病[4]等。因此，甲醛被世界卫生组织确定为致癌和致畸物质[5]，同时欧洲食品安全管理局（EFSA）建议经口摄入甲醛每天不得超过11 mg/kg[6]。虽然我国颁布的《食品卫生法》中明文规定禁止向食品中添加甲醛，但由于甲醛在防腐保鲜[7]、杀菌消毒[8]、增白等方面具有显著效果，一些不法商人将甲醛加入食品中，以达到提高食品亮泽度、延长保存期、改善口感等目的。

目前，有关食品中甲醛含量检测主要集中在肉制品[9]、水产品[10]、啤酒[11]等领域，对白酒中甲醛含量检测的研究较少。甲醛检测主要有分光光度法[12-13]、荧光

法[14-15]、色谱法[16]等。其中高效液相色谱法因具有灵敏度高、准确度好、干扰小、操作简单等特点被广泛运用于各行业中的甲醛含量检测[17]。因此，本研究在此基础上开发建立一种白酒中甲醛含量检测方法，以期为我国白酒中甲醛含量检测及食品安全提供科学有效的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料与试剂

样品：不同品牌市售白酒。

试剂及耗材：甲醛标准溶液(100 μg/mL，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司)；甲醇、乙腈（HPLC 级，美国Fisher 公司）；2,4-二硝基苯肼（HPLC 级，美国Sigma 公司）；乙酸钠、乙酸（分析级，国药集团有限公司）；水为超纯水。

1.1.2 仪器设备

高效液相色谱仪（赛默飞公司，UltiMate 3000，美国），电子分析天平（赛多利斯SQP，德国），数控超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司，中国），PURELAB-超纯水仪（PURELAB classic UV，英国），数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司，中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

2,4-二硝基苯肼溶液：精密称取2,4-二硝基苯肼适量至容量瓶中，用乙腈溶解并定容，制备成浓度为1.5 mg/mL的2,4-二硝基苯肼的溶液。

乙酸钠缓冲液：准确称取2.64 g 乙酸钠，用超纯水溶于500 mL 的容量瓶中，用乙酸调节pH 值至5。

衍生液：将2,4-二硝基苯肼溶液和乙酸钠缓冲液按照1∶1（V∶V）混合。

1.2.2 供试品溶液的制备

精确量取白酒样品0.8 mL 于10 mL 具塞比色管中，加入衍生液至刻度线，摇匀，置于60 ℃水浴中衍生30 min，取出，冷却至室温，取适量样品过0.22 μm有机相滤膜，即得。

1.2.3 色谱条件

色谱柱为Inertsil ODS-3-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇∶水（68∶32，V∶V），柱温40 ℃，检测波长360 nm，进样量20 μL，等度洗脱。

2 结果与分析

2.1 衍生条件的优化

2.1.1 衍生时间的确定

为确定最佳的衍生时间，在维持衍生温度不变的前提下，改变衍生的时间，比较在不同衍生时间下测得衍生产物含量的峰面积，结果如图1 所示。在60 ℃衍生温度条件下，随着衍生时间从15 min到30 min，衍生产物的峰面积呈逐渐增长的趋势；当衍生时间超过30 min时，衍生产物的峰面积逐渐下降。因此，确定最佳衍生时间为30 min。

图1 不同衍生时间衍生物峰面积变化曲线

2.1.2 衍生温度的确定

为确定最佳的衍生温度，在维持衍生时间不变的前提下，改变衍生温度，比较在不同衍生温度下测得衍生产物含量的峰面积，结果如图2 所示。随着衍生温度从40 ℃到60 ℃，衍生物的峰面积逐渐增大；当衍生温度从60 ℃上升到70 ℃时，衍生物的峰面积开始逐渐减少，说明当温度较低时，衍生不充分，而温度过高则会使衍生物不稳定。因此，确定最佳衍生温度为60 ℃。

图2 不同衍生温度衍生物峰面积变化曲线

2.2 标准曲线、线性范围及检出限

分别精确量取不同体积的甲醛标准溶液，置于10 mL 具塞比色管中，加衍生液至刻度线，混匀，配制成不同浓度的系列标准溶液，将上述标准溶液置于60 ℃水浴中衍生30 min，取出冷却至室温。精确吸取不同浓度的标准溶液20 μL，注入液相色谱，按照1.2.3 色谱条件进行检测，得到各浓度的色谱峰的峰面积，以浓度为横坐标，相对应的色谱峰面积为纵坐标建立标准曲线，得出线性关系及范围，见图3，在0.0125～1.0 mg/L 浓度范围内，线性关系良好，回归方程为Y=10.544X+0.0648（R2=1.0000）。该方法的检出限为1.5 μg/mL，能满足白酒样品中甲醛含量的检测。

图3 甲醛衍生物标准曲线

2.3 精密度实验

取同一白酒样品，按照1.2.2 供试品溶液制备方法制备供试品，按1.2.3 色谱条件进行连续进样6次，记录峰面积，检测结果见表1。结果显示，相对标准偏差为0.20 %，表明该方法具有良好的精密度。

表1 精密度实验结果

2.4 加标回收实验

取已知含量的同一批次的白酒样品0.4 mL，共9 份，分别添加不同水平的甲醛标准溶液，按照1.2.2 供试品制备方法进行样品制备，按照1.2.3 色谱条件进行测定，计算甲醛的回收率及相对标准偏差，结果见表2。由表2 可知，甲醛的加标回收率在93.27%～98.06%之间，相对标准偏差为1.98%，表明本方法准确度高，可以满足白酒样品中的甲醛含量检测。

表2 甲醛加标回收率(n=9)

2.5 样品检测

用建立的方法对不同品牌市售白酒中甲醛含量进行检测，检测结果见表3。由表3 可知，不同品牌市售白酒中的甲醛含量不同，这可能与其酿造工艺有关。

表3 市售白酒样品中甲醛检测结果

3 结论

我国是白酒消费大国，随着社会的发展和人民生活水平的提高，人们对酒的品质和安全越来越重视。但由于原料及酿造工艺的原因，使得白酒中残留微量甲醛。本研究建立了高效液相色谱法测定白酒中微量甲醛含量的检测方法，采用Inertsil ODS-3-C18色谱柱，以甲醇和水为流动相等度洗脱，检测波长360 nm。实验结果表明，该方法操作简单，稳定性好，准确度高，能够很好的运用于白酒中甲醛含量检测，为白酒中甲醛含量检测提供参考依据。