心力衰竭心脏移植患者心肌淀粉样蛋白沉积机制

罗林玉，张誉籍，赵继凯，徐银丽，于立明，薛晓东，王辉山

1.北部战区总医院 心血管外科，辽宁 沈阳 110016；2.大连医科大学，辽宁 大连 116044

心力衰竭是影响心脏的多种疾病的最终途径，发病率为1%～2%[1-2]。淀粉样蛋白沉积是心力衰竭的潜在病因[3]，可发生在心室和心房，以及血管(特别是小血管)周围和瓣膜，传导系统也可能牵涉其中[4]。淀粉样蛋白存在于全身，包括心肌、肾上腺、肾、肺、脾及周围神经等。本研究旨在观察心脏移植心力衰竭患者心脏标本中的淀粉样蛋白沉积情况。现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取北部战区总医院自2013年1月至2021年2月因风湿性心脏病进行瓣膜置换术的35例患者(风湿性心脏病组)和因终末期心力衰竭进行心脏移植的35例患者(心力衰竭组)为研究对象。两组患者均由同一术者进行手术。风湿性心脏病组纳入标准：患有风湿性心脏瓣膜病；左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)>0.4；心功能Ⅰ～Ⅱ级；临床诊断达到瓣膜置换术标准；临床资料完整。心力衰竭组纳入标准：心脏疾病已到晚期；LVEF<0.4；心功能Ⅲ～Ⅳ级；临床诊断达到心脏移植标准；临床资料完整。本研究经医院伦理委员会批准。患者均知情同意。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 柠檬酸钠抗原修复液(KGIHC001)、一步法免疫组化试剂盒(KGOS60)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；APP(#2452)、GAPDH(14C10)、β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)(1-42)(D9A3A)、Aβ(1-40)(D8Q71)购自美国CST公司；辣根过氧化物酶山羊抗兔二抗(abs20040)、刚果红(abs42221387)购自北京爱必信生物技术有限公司；DAB显色液(DA-1015)、DAPI(C0065)购自北京索莱宝公司；Masson三色染色液(BA-4079B)购自贝索公司；盐酸乙醇快速分化液(C0163S)、BCA试剂盒(P0010)购自上海碧云天生物技术有限公司；ECL显影液(P10300)购自苏州新赛美生物科技有限公司。

1.2.2 主要仪器 低温高速台式离心机(Neofuge23R)购自上海力申科学仪器有限公司；超低温冰箱(DW-86W420)购自青岛海尔股份有限公司；Multiskan23R FC酶标仪购自美国Thermo公司；Bio-Rad凝胶蛋白分离系统购自美国Bio-Rad公司；凝胶曝光系统购自Tanon公司；石蜡包埋机(EG1150H+EG1150C)购自Leica公司；制冰机(YT-IMS-45)购自恒隆仪器有限公司；激光共聚焦显微镜(Nikon C2)购自日本Nikon公司。

1.3 研究方法

1.3.1 临床资料 收集并记录患者的年龄、住院天数、性别、超声心动图检查结果，以及氨基末端脑利钠肽(N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)水平。

1.3.2 免疫组化 分别从风湿性心脏病组和心力衰竭组随机选取10例患者，收集左室标本。将标本制成4 μm厚度的切片。采用SP免疫组化法进行染色。脱蜡修复后滴加Aβ1-40抗体(1∶200)、Aβ1-42抗体(1∶200)，4℃冰箱孵育过夜。次日取出复温，生物素标记的二抗37℃孵育20 min，滴加现配DAB进行显色。目标抗体表达显示为棕色，表达量以其占整个观察视野的面积百分比表示。

1.3.3 Western Blot 收集待测组织，离心后留取细胞沉淀于1.5 ml EP管中，提取总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度，对各样品进行蛋白定量，置入100℃沸水中5 min，冷却后-80℃保存。采用8%的SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳，配制浓缩胶电泳1 h，电转移法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，APP抗体(1∶1 000)4℃过夜，次日TBST洗涤5次，每次8 min，二抗室温孵育1 h，TBST再次洗涤5次，每次8 min，ECL显色发光，照相。

1.3.4 Masson染色 将切片脱蜡至水，采用马松三色染色法进行染色。染色后，肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色或绿色。

1.3.5 刚果红染色 将切片脱蜡至水，采用High-man甲醇刚果红染色法进行染色。染色后，心肌组织标本中的淀粉样纤维呈红色，细胞核呈蓝色。

1.3.6 免疫荧光染色 将切片4.0%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100打孔、5.0% BSA封闭1 h后，滴加Aβ1-42抗体(1∶50)，4℃孵育过夜。次日PBS洗涤3次，每次5 min，避光加FITC标记的荧光二抗(1∶50)，室温孵育1 h。DAPI对细胞核进行染色，滴加甘油进行封片，低温避光保存。激光共聚焦显微镜成像观察。染色后，Aβ呈绿色，DAPI呈蓝色。

2 结果

2.1 两组临床资料 风湿性心脏病组中，男性27例，女性8例；年龄(58.92±12.13)岁；住院天数(22.51±6.69)d；LVEF(54.51%±10.86%)；NT-proBNP (1 515.54±1 297.10)pg/ml。心力衰竭组中，男性29例，女性6例；年龄(51.43±10.41)岁；住院天数(27.71±21.51)d；LVEF(33.15%±12.57%)；NT-proBNP (4 437.00±3 138.00)pg/ml。

2.2 两组Aβ表达水平比较 心力衰竭组Aβ表达水平高于风湿性心脏病组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1～3。

图1 两组Aβ表达水平比较(刚果红染色；a.风湿性心脏病组，b.心力衰竭组)图2 两组Aβ表达水平比较(免疫荧光染色；a.风湿性心脏病组，b.心力衰竭组)

图3 两组Aβ表达水平比较(免疫组化)

2.3 两组胶原纤维表达水平比较 心力衰竭组胶原纤维表达水平高于风湿性心脏病组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 两组胶原纤维表达水平比较(Masson染色)

2.4 两组APP表达水平比较 心力衰竭组APP表达水平高于风湿性心脏病组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 两组APP表达水平比较(Western Blot)

3 讨论

淀粉样变性是淀粉样蛋白原纤维在多个器官中的细胞外沉积而引起的一组疾病。淀粉样纤维主要成分为心房钠尿肽及其前体形式的氨基末端部分[5]。Sanbe等[6]研究指出，淀粉样寡聚体存在于人类心力衰竭患者心肌细胞和动物结蛋白相关心肌病模型中。心脏作为内分泌器官，可产生心房钠尿肽[7-8]和脑利钠肽[9]，两者通过激活鸟苷酸环化酶A受体，促进第二信使3’，5’-环鸟苷一磷酸生成[10]，介导心肌保护及代谢功能，如抑制心肌细胞肥大和心肌纤维化、增强舒张功能、促进脂肪分解和白色脂肪细胞褐化等[11]。心房钠尿肽和脑利钠肽水平升高是心力衰竭的一个标志[12]。NT-proBNP是脑利钠肽前体降解后的化学结构之一，可用于诊断心力衰竭。本研究中，心力衰竭组患者NT-proBNP水平明显升高。

APP是β-淀粉样前体蛋白，在体内代谢为Aβ，细胞外和细胞内Aβ(包括单体、寡聚及纤维形式)之间会通过多种机制引起小胶质细胞浸润、活性氧产生及突触损伤等[13]。心肌中含有丰富的心脏成纤维细胞，约占心脏细胞群的10%～20%[14]。持续不断的肌成纤维细胞活化驱动会引起过度纤维化，导致心脏组织顺应性下降，营养和氧气输送减少，心肌细胞萎缩及死亡，诱发进行性左室扩张和功能障碍[15-17]。本研究中：经刚果红染色、免疫荧光染色、免疫组化，心力衰竭组均出现Aβ表达，且表达水平高于风湿性心脏病组，差异有统计学意义(P<0.05)；Masson染色可见心力衰竭组胶原纤维表达水平高于风湿性心脏病组，差异有统计学意义(P<0.05)；Western Blot提示，心力衰竭组APP表达水平高于风湿性心脏病组，差异有统计学意义(P<0.05)。由此推测，心力衰竭患者心肌中出现Aβ沉积可能与心肌纤维化有关，而这个过程可能由APP相关通路介导[18]。

综上所述，心力衰竭的心脏移植患者出现心肌淀粉样变性和心肌纤维化现象，心肌中Aβ沉积可能与心肌纤维化有关，且这个过程可能由APP相关通路介导。