1家系2例X-连锁低血磷性佝偻病基因突变研究*

王怀波 殷常瑜 郭伟韬 何生 刘思景 张锦祥 邹尚浏

(广东医科大学附属第二医院骨科，广东 湛江 524000)

X-连锁低血磷性佝偻病(X-Linked Hypophosphatemicrickets，XLH)是一种以肾脏磷酸盐排泄增多引起低磷血症为特征的骨代谢异常性疾病，其患病率为1/20000，最早由Albright等报道[1]。XLH为X染色体显性遗传，多为家族性发病，部分为散发性病例。主要临床表现为骨骼发育不良、畸形、身材矮小、骨质疏松、骨痛和牙釉质发育不良等[2]，成年患者主要症状包括软骨病和骨关节畸形[3]，生化方面主要表现为低血磷、1,25(OH)2D3水平正常或偏低、血钙正常，甲状旁腺激素(PTH)正常，碱性磷酸酶水平升高，高尿磷，低尿钙等。其临床表现与维生素D缺乏性佝偻病比较相似，但按照维生素D缺乏性佝偻病的治疗并不能改善症状，容易误诊延误病情。早期诊断和及时治疗是决定预后的关键[4]。本研究采用全外显子组测序并应用QPCR对一家系XLH突变基因PHEX进行分析，同时给予药物和手术干预，从而探讨该家系XLH的致病机制和临床治疗效果。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年我院经过全面临床评估的疑似XLH的1家系2例患儿为研究对象，家系图谱见图1。

图1 XLH家系图谱

1.1.1 病例1 先证者Ⅱ:1为9岁男性，因“生长发育迟缓，双下肢“O”型腿6年余。”于2016年11月至我院骨科门诊。该患儿为第一胎第一产，2岁开始站立行走，自幼较同龄儿童生长发育迟缓，身材矮小，双下肢呈“O”型畸形，能正常活动。诊断为“佝偻病”，予补充钙、维生素D等治疗，上述症状未见明显好转，双下肢“O”型改变逐渐加重。于2017年3月行双下肢DR示：双膝关节内翻畸形，呈“O”形改变，干骺端宽大呈“杯口状”，双下肢各骨普遍骨质疏松，符合佝偻病活动期改变，见图2A。考虑到患者双下肢畸形严重，于2017年4月收入院并行“双股骨截骨矫形术”，术后复查下肢DR示股骨截骨对位、力线可，内固定物位置良好，见图2B。术后6个月复查下肢DR示股骨截骨处仍未见明显愈合，见图2C。

图2 先证者Ⅱ:1影像学资料

家族史：母亲和妹妹有类似病史，父亲身体健康，其他家族成员无类似病史，患儿母亲自幼身体发育迟缓，行走年龄较同龄儿童晚，身高1.25米，存在双下肢“O”型畸形，行走呈摇曳步态，可做简单家务，间有骨骼疼痛。体格检查：身高102 cm(-5.6 SD)，体重21 Kg。发育较同龄儿童低下，脊柱生理弯曲正常，双膝关节内翻畸形，呈“O”型改变，四肢关节活动正常，四肢肌力、肌张力正常，心肺腹查体未见异常。实验室检查：血磷 0.68 mmol/L，血钙 2.37 mmol/L，碱性磷酸酶559 U/L，尿磷6.05 mmol/L，尿钙1.42 mmol/L，甲功7项、皮质醇未见异常。影像学检查：胸部X线检查：胸廓大致对称，左侧肋骨形态欠佳，未除外陈旧性骨折畸形愈合，双侧前肋边缘模糊，气管居中。双下肢及腕关节X线检查：四肢骨骨质密度减低，双侧尺桡骨、双侧股骨、双侧胫腓骨干骺端模糊，边缘毛糙呈“毛刷状”改变，拟佝偻病。四肢关节对位良好，关节间隙无明显增宽或变窄。

1.1.2 病例2 患者Ⅱ:2为4岁女性，为先证者Ⅱ:1妹妹，因“生长发育迟缓，双下肢“O”型腿2年余”于2018年1月至我院骨科门诊就诊，第二胎第二产，生长发育迟缓，身高较同龄儿童低，双下肢出现“O”型畸形。家族史：母亲和哥哥有类似病史，父亲身体健康，其他家族成员无类似病史，患者母亲自幼身体发育迟缓，行走年龄较同龄儿童晚，身高102 cm，存在双下肢“O”型畸形，行走呈摇曳步态，可做简单家务，间有骨骼疼痛。体格检查：身高90 cm(-5.0 SD)，体重14 Kg，发育较同龄儿童低下，脊柱生理弯曲正常，双膝关节内翻畸形，呈“O”型改变，四肢关节活动无障碍，四肢肌力、肌张力正常，心肺腹检查未见明显异常。实验室检查：血磷0.87 mmol/L，血钙2.4 mmol/L，碱性磷酸酶667 U/L。影像学检查：双下肢DR示：骨质密度减低，干骺端模糊，呈“杯口状”膨大，边缘呈“毛刷状”改变，双下肢变形呈“O”形腿，符合佝偻病表现，见图3。

图3 患者Ⅱ:2影像学资料

1.2 全外显子组测序和突变验证 本研究遵循《赫尔辛基宣言》关于人体医学研究的道德原则，同时通过我院伦理审查委员会审查及患者家属知情同意。

1.2.1 全外显子组测序 抽取患儿外周静脉血5 mL至EDTA抗凝管，使用Qiagen全血DNA提取试剂盒提取基因组DNA，使用Covaris LE220超声波仪将DNA样本打断成主带为300 bp左右的DNA片段，然后使用AMPure XP beads进行磁珠筛选，DNA片段末端补平后，在3′ 端加碱基“A”，使DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接，经过LM-PCR扩增并纯化后，完成单个受检者样本的文库构建。使用定制的基因片段捕获探针(Roche NimbleGen，Madison，USA)，与10～20个标记好的患者DNA文库在PCR仪中47℃下杂交16～24 h，杂交结束后进行探针的洗涤和洗脱反应，随后进行捕获样品的Post-PCR反应。样本使用Agilent 2100 生物分析仪进行DNA文库片段长度、浓度检测，质量合格的样本按照有效浓度和目标下机数据量pooling、定量。将pooling文库进行环化形成单链环状DNA，然后扩增2～3个数量级形成DNA纳米球(DNB)，使用Pattern array技术实现DNB在硅芯片上的固定，最后使用高通量测序仪BGISEQ-500进行50个循环测序，得到原始测序数据。(该过程在深圳华大基因公司进行)。

1.2.2 序列分析 数据下机后进入信息分析部分。首先对下机的原始数据进行质控，去除低质量以及被接头污染的reads。随后用对比软件BWA将样本与人的参考基因组HG19/HG20进行序列比对得到样本全部变异位点信息，突变类型。使用GATK软件做局部重对比和碱基质量值重校正处理。基于对比结果得到每个样品的测序深度、覆盖度、对比率等指标。接下来使用GATK v3.3.0的HaplotypeCaller检测基因组变异，包括SNP(Single-Nucleotide Polymorphism)和Indel(Insertion And Deletion)并过滤掉NCBI dbSNP，HapMap，1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults数据库正常人群变异频率大于0.01的变异，使用SnpEff软件对变异结果进行注释及影响预测。PHEX基因除了点突变致病外，还可出现拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)。对于全外显子组测序未找到PHEX基因突变者，推测可能存在CNVs，使用基于深度信号方法的CNVnator检测CNVs。接下来通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法对PHEX基因CNVs进行验证。

1.2.3 QPCR验证 登录GenBank数据库下载PHEX基因序列，使用Primer 5软件按照引物设计原则由深圳华大基因公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

取血液样本100 μL行总RNA提取，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒去除基因组DNA，随后加入PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×PrimeScript Buffer 2 4 μL、无核酸酶水4 μL进行逆转录反应。反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反应结束得到总cDNA。在25 μL反应体系中，含SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (2×)12.5 μL、PCR Forward Primer (10 μL) 1 μL、PCR Reverse Primer (10 μL)1 μL、cDNA2 μL、灭菌蒸馏水8.5 μL。反应条件如下：95 ℃ 10 min→(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)× 40 cycles→95 ℃ 15 s→ 60 ℃ 1 min→ 95 ℃ 15 s→得到融解曲线。本研究用2-ΔΔCt值相对定量法将数据转化成线性形式分析，所得结果是实验组中参照基因表达水平校准的目的基因相对于对照组中目的基因增加或减少的倍数。相对定量RQ(relative quantity)=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目标基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。

2 结果

2.1 临床治疗随访 对先证者Ⅱ:1确诊后，给予口服磷酸盐合剂(磷酸二氢钠1.8 g，磷酸氢二钠14.5 g，加水至100 mL)，15～20 mL/次 ，每天4～5次。同时罗钙全40 ng/kg每天分两次服用。服药期间定期复查血磷、血钙等，根据检查结果调整药物剂量，防止高血钙发生。定期复查肾脏彩超未发现肾钙质沉着，复查下肢DR了解病情变化及截骨处骨折愈合情况，治疗6个月后股骨截骨处愈合并取出内固定，见图4。根据中国儿童身高标准生长曲线[5]，将身高转换成身高标准差SDS，计算公式为身高SDS=(实际身高-同年龄同性别平均身高)/同年龄同性别人群身高标准差。经过24个月治疗后，患者身高较前有明显增长，由102 cm升至127 cm，身高SDS由-5.6 SD升至-2.8 SD。

图4 先证者Ⅱ:1术后16个月、治疗后6个月后双下肢DR

对患者Ⅱ:2确诊后，给予口服磷酸盐合剂(配方同上)，15～20 mL/次 ，每天4～5次。同时罗钙全40 ng/kg每天分两次服用。嘱其定期复查生化指标，根据检查结果调整药物剂量。定期复查肾脏彩超未发现肾钙质沉着，复查下肢DR了解病情变化，考虑到患儿双下肢畸形严重，于2018年8月行“双股骨、胫骨截骨矫形术”，术后6个月截骨处骨折愈合，并于2019年7月行“双股骨、胫骨内固定物取出术”，见图5A～B。经过24个月治疗后，患者身高较前有明显增长，由82 cm升至103 cm，身高SDS由-5.0 SD升至-2.3 SD。

图5 患者Ⅱ:2 术后随访影像学资料

2.2 基因检测结果 对OMIM数据库收录明确致病关系的所有基因进行分析，未发现与受检者临床表现相符的致病变异。这两例患儿出现PHEX基因CNVs，通过对比患儿PHEX基因测序结果与正常序列得到具体CNVs为PHEX Exon10-11 del。使用引物X-PHEXex10和X-PHEXex11得到扩增曲线图(Amplification Plot)、原始荧光组分曲线图(Multicomponent Plot)、熔解曲线(Melt Curve)，见图6～8。计算得到先证者Ⅱ:1的PHEX ex10、PHEX ex11相对定量RQ值为0，患者Ⅱ:2的PHEX ex10相对定量RQ值为0.53，PHEX ex11相对定量RQ值为0.52，见图9。在男性X染色体中，RQ≤0.1代表纯和缺失；在女性X染色体中，0.4≤RQ≤0.6代表杂合缺失。证实致病基因突变为PHEX Exon10-11 del，先证者Ⅱ:1为半合子突变，患者Ⅱ:2为杂合突变。

图6 扩增曲线图表现为标准的S型曲线

图7 原始荧光组分曲线图出现正常的阳性扩增曲线

图8 熔解曲线图出现一个较窄的单峰表示扩增具有极好的特异性

图9 先证者Ⅱ:1和患者Ⅱ:2的RQ值

3 讨论

XLH是由PHEX基因突变功能缺失引起，是遗传性佝偻病中最常见的疾病[6]。由于其临床表现与维生素D缺乏性佝偻病相似，常被误诊维生素D缺乏性佝偻病，国内已有多篇类似报道[7-8]。本研究中病例1的男性患儿曾在我院误诊，误诊原因为对XLH发病机理认识不足，对儿童佝偻病不能很好的进行鉴别诊断。以往研究[9-10]显示，XLH发病机制是PHEX基因突变使具有水解作用的PHEX蛋白失去功能，失去功能的PHEX蛋白对FGF23水解作用消失导致其在体内堆积。FGF23可通过调节肾脏磷酸盐排泄、维生素D的产生和肠道对磷酸盐的吸收来降低血磷和1,25(OH)2D3水平[11-13]，最终发生低磷血症导致骨矿化不足等一系列骨并发症。在本研究中，对临床工作中发现的一个家系两个疑似XLH患者进行基因检测，显示存在PHEX基因拷贝数变异(CNVs)：PHEX Exon10-11 del。这说明本XLH家系的致病基因亦是PHEX。同时本家系研究显示先证者Ⅱ:1(男性)为半合子突变，患者Ⅱ:2(女性)为杂合突变，证实了XLH的发病为X染色体连锁显性遗传模式。

XLH患者的临床表现异质性强，同一家系的成员临床表现、严重性可不一样，甚至相同PHEX突变的患者临床表现也可不同[14]。本研究中两例患儿在下肢畸形程度、佝偻病严重程度及生化参数上并没有显著差异，但在治疗前后患者Ⅱ:2(女性)的身高SDS值较先证者Ⅱ:1(男性)高。男女之间不同的突变型是否影响疾病的严重程度，多项关于性别与疾病表型严重程度研究得到的结论各不一致。有研究表明女性患者临床症状往往比男性患者更轻[15]，这可能是因为女性杂合子上正常X染色体等位基因的功能性补偿作用[16]，但也可能与非基因因素有关。在后续的研究中将扩大样本量，将对PHEX基因表型和异质性进一步探讨。

全外显子组测序是一种利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕获富集后进行高通量测序的技术，可选择性的对人类基因组的编码区进行测序，从而发现罕见及常见疾病相关的异常基因[17]。与昂贵的全基因组测序相比，全外显子组测序更适用于临床的高深度测序技术。虽然全外显子组测序可检测突变包括约2万个基因的点突变及20 bp以内的小片段缺失或插入突变，但无法完全覆盖高重复、高复杂度或假基因区域，不能对基因组结构变异如CNVs、大片段插入突变如ALU介导的插入进行检测。本研究中对于患儿样本进行全外显子组测序未找到PHEX基因突变，推测可能存在PHEX基因拷贝数变异(CNVs)。通过对比与患儿PHEX基因一同上机的其他正常样本PHEX基因的测序深度，最终找到CNVs，证实了这一推测。

当前XLH的药物治疗首选方案是磷酸盐联合骨化三醇[18]。本次研究的两名儿童患者使用该疗法治疗后较治疗前身高SDS有明显升高，使用该疗法6个月治疗后截骨处达骨性愈合。这说明该药物联合方案对本家系XLH确实有效。以往研究显示，在该方案治疗中30%～80%的患者中出现肾结石和甲状旁腺功能亢进[19]。本研究中暂未观察到这样的并发症，可能是样本量较小或是随访时间还不够长，在后期随访中将重点关注此类并发症。对于严重畸形的患者除了药物治疗外可能还需要手术治疗。Petje等[20]甚至建议患者在畸形的早期阶段进行手术矫正，并计划在整个发育过程中进行2～3次手术。本研究中的两名患儿由于双下肢严重畸形而行截骨矫形手术，术后双下肢畸形得到较好的纠正，目前截骨部位已骨性愈合并拆除了内固定，患儿活动正常。远期效果如何，畸形是否会再次复发还需要继续观察。

4 结论

PHEX Exon10-11 del突变是这个XLH家系发病的主要原因。患儿目前首选磷酸盐合剂和骨化三醇联合治疗，对下肢畸形严重的患儿选择合适的手术治疗可取得不错的效果。