靶向抑制 PI3K 对PDK-1/Akt信号通路调控成骨细胞分化的影响*

陈巧玲 白亦光 别俊 杨蜜 张加勇

(南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院 1.肿瘤科;2.骨科， 四川 南充 637000)

骨是一种有活力的组织器官，在形成和溶解的动态状态下保持平衡。其中成骨细胞是骨形成的重要细胞，参与维持机体的矿物质平衡[1]。当成骨细胞的分化过程受到阻碍，或者破骨细胞的活性亢进，都会导致骨质疏松症等疾病[2]。骨质疏松症是一种全身性的骨骼疾病，其特点是骨质微结构的退化，包括骨量减少和骨质脆性增加，这种变化增加了骨折的风险[3]。在骨质疏松的发生、发展过程中，成骨细胞的功能状态具有重要作用[4]。另外，在肿瘤骨转移等疾病发生发展过程中，由于肿瘤细胞的侵犯而导致成骨细胞的凋亡或分化功能的抑制，加重疾病的病程进展[5]。因此，研究成骨细胞的功能调控对于深入认识骨重建的过程及骨代谢疾病的防治具有重要价值。

磷脂酰肌醇3-激酶( PI3K)/ Akt 信号通路是正常生理状态下细胞的基础代谢通路，广泛参与真核细胞的增殖、分化和能量代谢等过程[6]，并且在肿瘤的发生、发展过程中还参与了肿瘤细胞的能量代谢[1]。本研究拟通过对PI3K蛋白的靶向抑制，探讨在成骨细胞分化成熟的过程中，成骨细胞细胞外基质的分泌情况和PI3K/Akt 信号通路下游蛋白表达的变化，从而更深入地认识靶向PI3K/ Akt 信号通路在成骨细胞分化过程中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和实验动物 胎牛血清( FBS，Gibco BR)； LY294002(美国 Sigma 公司)；0.25%胰蛋白酶(美国 Sigma 公司)； PBS工作液(碧云天，中国)；DMEM培养液(美国 Sigma 公司)；成骨细胞诱导培养基(OBM，美国Hyclone 公司)；4%多聚甲醛细胞固定溶液(碧云天，中国)；ALP染色试剂盒(碧云天，中国)；ALP活性分析试剂盒(碧云天，中国)；1%茜素红染色液(pH4.2，bio-channel，中国)；GAPDH(D16H11)兔单克隆抗体(#5174)和PDK-1(D37A7)兔单克隆抗体、p-PDK1(C49H2)兔单克隆抗体和p-AKT(D25E6)兔单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology，Inc.)E.Z.N.A.总 RNA 提取试剂盒I(美国Hyclone 公司)；二抗抗兔辣根过氧化物酶结合IgG，1:1000；#58802(美国Cell Signaling Technology，Inc)。动物来源C57BL/6小鼠2只(4～6周龄，雌雄各1只)，购自川北医学院动物中心。所有动物的实验操作在川北医学院伦理委员会监督下进行。

1.2 骨髓间充质干细胞(BMSC)的培养 从无菌条件下分离小鼠股骨和胫骨，使用含有肝素的注射器冲洗骨髓腔，收集小鼠骨髓腔冲洗液，转移到离心机100×g离心5 min，使用15%FBS的DMEM培养基重新悬浮的细胞，并转移至T75细胞瓶中，放置恒温培养箱内继续培养，每2～3 d更换培养基一次。待细胞融合率达70%～80%后进行传代培养。

1.3 成骨细胞的诱导和实验分组 收集第三代BMSC，以5×103个/cm2的密度接种于预先包被明胶的6孔培养板中，当细胞融合度达到60%～70%时，每孔加入2 mLOBM，然后在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。OBM需在37 ℃预热，每隔3 d更换一次新鲜的OBM。诱导1周后，为避免成骨细胞脱落，每2 d将全培养基换成半培养基。对照组只使用OBM治疗。LY294002组用在OBM中加入3 μM的LY294002进行处理。

1.4 CCK-8检测BMSC的增殖以及LY294002的安全浓度 将BMSC接种于96孔板上，接种密度为1×104个/孔，添加三个副孔，在15%FBS的DMEM培养基中培养。1 d后，用不同浓度的LY294002(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μM)孵育48 h和96 h，每孔加入10 μL CCK-8缓冲液孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长条件下读取OD值。

1.5 碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色 ALP染色：将待染细胞用PBS清洗5次，4%多聚甲醛细胞固定液固定30 min， PBS冲洗3～5次，配制并添加ALP染色工作液37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3～5次，倒置显微镜下观察并采集图片，并用ALP活性分析试剂盒检测ALP的活性。

茜素红染色：将待染细胞用PBS清洗5次,4%多聚甲醛细胞固定液固定30 min，PBS洗涤3～5次，用1%茜素红染色工作液染色20 min。待肉眼可见工作液中出现红色棉絮状沉淀后，用PBS洗涤3～5次，显微镜观察并采集图像。体外矿化能力定量检测：将细胞在10%的氯化十六烷基吡啶中连续搅拌，在室温下过夜脱色。使用酶标仪562 nm波长下读取OD值，标准化后获得矿化定量值。

1.6 Western-Blot 使用RIPA蛋白裂解试剂盒说明书提取总蛋白。每孔加入1 mL蛋白裂解缓冲液，在4 ℃下裂解细胞30 min，4 ℃下收集裂解液，收集上清液，用比色法测定蛋白质浓度，用10%的 SDS-聚丙稀酰胺凝胶分离蛋白，湿式电转移法将蛋白转膜后，取出 PVDF 膜，用洗涤缓冲液在摇床上洗膜 10 min，在37 ℃的5%抗体封闭液中孵育1 h，并在4 ℃下与一抗孵育过夜：抗p-PDK1(稀释度1∶1 000)，抗GAPDH(稀释度1∶1 500)和抗p-AKT(稀释度1∶1 000)。加入二抗(稀释度1∶1 500)，将样品在37 ℃孵育1 h，取出PVDF膜，在Odyssey机上扫膜，并分析灰度值。

1.7 Real-time PCR测定结果 根据E.Z.N.A.Total RNA Kit I试剂盒说明书提取并获得细胞系的总RNA，使用QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix配制PCR反应液。使用的mRNA引物如下：骨钙素(OCN)，5′-TCTGACAAAGCCTTCATGTCC-3′，5′-AAATAGTGATACCGTAGATGCG-3′。ALP，5′-GTGACTACCACTCGGGTGAAC-3′，5′-CTCTGGT GGCATCTCGTTATC-3′。GAPDH, 5′-GCATCTC CCTCACAATTTCCA-3′，5′-TGCAGCGAACTTTA TTGATGGT-3′。用标准样品计算OCN和ALP基因表达，并与GAPDH基因表达进行归一化。

2 结果

2.1 LY294002对BMSC的细胞活性影响 LY294002的分子结构式见图1A。药物浓度在6.4 μM时会对BMSC的细胞活性产生抑制作用(P<0.05)，见图1B；药物浓度在3.2 μM及以下时未见明显的抑制细胞增殖活性作用。

图1 LY294002的分子结构式和不同药物浓度对BMSC的细胞活性的影响

2.2 LY294002对成骨细胞的分化呈剂量依赖性 OBM培养基中添加不同剂量的LY294002，对BMSC进行成骨细胞方向诱导，使用ALP染色法对成骨细胞的细胞外基质中ALP的表达进行鉴定。LY294002的浓度梯度设置为1、2、3 μM，结果显示LY294002对成骨细胞的分化对产生不同程度的影响，呈现出剂量依赖性(P<0.05)，见图2。

图2 不同浓度的LY294002对成骨细胞分化的影响

2.3 LY294002 抑制成骨细胞ALP的表达和细胞矿化能力 添加浓度为3 μM的LY294002至OBM为干预组，观察成骨细胞外基质ALP和矿化能力的变化，发现ALP阳性细胞的数量明显减少(图3A)。茜素红染色提示，细胞外钙结节的数量也明显减少(图3B)，同时对ALP活性和细胞外基质矿化定量检测，发现结果同ALP和茜素红染色结果一致(图3C～D)。这提示LY294002 明显抑制了成骨细胞外基质的形成。

图3 LY294002对成骨细胞外基质的影响

2.4 LY294002下调了p-PDK1和p-Akt蛋白的表达 免疫印迹所示，LY294002存在的情况下，细胞中磷酸化的PDK-1 和Akt出现明显的下调(均P<0.05)，表明LY294002通过调控PDK-1 /Akt信号通路对成骨细胞分化产生影响，见图4。

图4 成骨细胞p-PI3K和p-Akt蛋白的表达

2.5 LY294002下调了成骨细胞相关基因ALP和OCN mRNA的表达 使用real-time PCR对成骨细胞分化早期的ALP以及在成骨细胞分化晚期的OCN基因进行检测，结果提示LY294002下调了成骨细胞相关基因ALP和OCN mRNA的表达(P<0.05)，见图5A～B。

图5 成骨细胞相关基因的表达

3 讨论

PDK-1/AKT信号通路参与调节体内正常细胞以及肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运，特别是凋亡和细胞存活[7]。PI3K作为PDK-1/AKT信号通路的上游调控蛋白，是几条凋亡途径中的关键控制点[8]。当PI3K被激活时，可以诱导第二信使PIP2和PIP3[9]。AKT是PI3K和PIP3的重要下游靶点，它可以与质膜上募集的PIP3相互作用，然后被PDK-1部分磷酸化并激活[10]，从而调节下游通路，促进细胞存活。目前针对该信号通路对成骨细胞的分化作用研究较少。本研究通过靶向抑制PI3K，观察对体外诱导成骨细胞分化的影响，旨在了解靶向抑制PI3K对骨质破坏或骨质疏松治疗的作用机制。

BMSC是体内成骨细胞的主要来源[11]。在体外诱导BMSC向成骨细胞分化的过程可以模拟体内形成成骨细胞成熟的过程[12]。在本实验中，采用体外培养C57BL/6小鼠BMSC，通过CCK-8检测获得LY294002的安全浓度，在3.2 μM及以下浓度安全浓度范围以下，发现在对BMSC的增殖活性并没有产生影响。但在OBM中添加不同浓度的LY294002对BMSC进行诱导发现，成骨细胞的分化成熟产生了阻碍，这种影响呈现剂量依赖性。之后，对细胞进行分组，对照组使用OBM处理BMSC，干预组在OBM中添加LY294002，通过细胞形态学观察并检测细胞ALP活性和体外矿化能力，结果提示干预组ALP阳性细胞和细胞外基质矿化明显减少(P<0.05)。采用Western -Blot和RT-PCR检测PDK-1/Akt通路及下游转录因子基因和蛋白的表达水平。观察两组细胞在成骨分化过程中的变化。结果显示干预组p-PDK-1和p-Akt蛋白表达水平较对照组明显降低。干预组成骨细胞相关基因ALP和OCN mRNA较对照组明显下降。

mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素可以抑制成骨细胞分化[13]。Pan等[14]发现抑制PI3K激酶可阻断胎鼠颅骨细胞的ALP活性。Bai等[15]发现特异性抑制PDK-I蛋白的表达可以阻碍成骨细胞的分化成熟。那些研究的结果与本研究结果相似。有学者[16]认为成骨细胞分化最初由BMSC收到一系列调控因素而产生细胞外基质，并表达成骨细胞生长所需要的调节因子。随后细胞外基质分泌逐渐成熟，碱性磷酸酶表达增强和胶原蛋白沉积增加[17]。在最后矿化的阶段，骨涎蛋白和OCN的表达和分泌增加，最终开始履行骨形成的生物活性[18]。本研究在诱导分化过程中也进一步证实了这一过程。OBM主要成分为抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松。该培养基能促进BMSC向成骨细胞分化，已被广泛接受。这些成分被认为是BMSC矿化成熟的必要条件[19]。BMSC在这一过程中分化成熟并获得了成骨细胞的形态和生长特性[20]。

4 结论与启示

本研究结果显示，通过对PI3K蛋白的抑制，PI3K/Akt信号通路中明显下调了p-PDK-1和p-Akt蛋白表达水平，成骨细胞相关基因ALP和OCN mRNA表达也明显下降。但PI3K/AKT信号通路中下游的蛋白是如何变化的尚不清楚。在后续研究中，将开展一些体内研究，以期获得治疗骨质代谢疾病或肿瘤骨质破坏的新靶点。