伊伐布雷定通过调控TIMP-1表达对冠心病大鼠抗心肌纤维化和心肌保护作用的机制*

白延平 陈俊民 刘智娜

(延安大学附属医院 1.心内科；2.麻醉科，陕西 延安 716000)

心血管疾病是全球范围内引发死亡和残疾的主要原因，冠心病(Coronary Heart Disease)为心血管疾病之一，严重危害人类健康，其导致的死亡约占心血管疾病的一半[1]。冠心病的主要特征是动脉粥样硬化，可能致使血管腔狭窄或发生阻塞，从而导致缺血性心脏疾病的发生，如心绞痛和心肌梗塞[2-4]。伊伐布雷定(Ivabradine)是一种特殊的降低心率药物，可选择性地抑制窦房结细胞中的If电流，而不影响心肌收缩功能和血管以及房室、心室内的传导功能[5]。研究表明，伊伐布雷定具有缩小梗死面积、改善心功能、减轻心室重塑和延缓心力衰竭等作用，并且可以减轻心肌细胞凋亡和心脏功能障碍，发挥多效的心脏保护作用[6-7]。然而其在冠心病心肌纤维化过程中的作用与分子机制的相关研究报道却相对较少。本研究通过构建冠心病大鼠模型，探讨伊伐布雷定对冠心病大鼠抗心肌纤维化及心肌损伤的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级，雄性SD大鼠60只，鼠龄7～8周，体重180～220 g，购自延安大学医学院实验动物中心。本研究经延安大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 伊伐布雷定(法国Servier公司)；维生素 D3注射液(江苏吴中医药集团有限公司)；胎牛血清(美国 Gibco公司)；超氧化物歧化酶试剂盒和总丙二醛剂盒(南京建成生物工程研究所)；脑钠肽检测试剂盒(上海百沃科技有限公司)；苏木精-伊红染色试剂(上海蓝季科技发展有限公司)；Masson 染色试剂盒(北京世洛合力试剂公司)；抗体TIMP-1、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、Cleaved-Caspase3、Bcl-2、Bax(北京中杉金桥生物有限公司)；抗体GAPDH和HRP标记山羊抗兔IgG(美国Abcam公司)；免疫组化染色试剂(上海古朵生物科技有限公司)；RIPA 裂解缓冲液、BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组、造模及给药 将SD大鼠适应性喂养1 周，按照随机数字表法将60只大鼠随机分为4组，包括对照组、模型组和伊伐布雷定低、高剂量组，每组15只。对照组大鼠给予基础饲料(配方：玉米73.5%、麦麸20%、鱼粉5%、谷粉1%、食盐0.5%)喂养。其他3组大鼠参照文献[8]方法构建冠心病大鼠模型：大鼠每日给予高脂食物(配方：基础饲料78.8%、胆固醇1%、牛胆盐0.2%、蛋黄粉10%、猪油10%)连续喂养，腹腔注射维生素D3 (0.7 mL/kg)，连续注射 3 d。12 周后，检测大鼠心电图，T 波抬高则表示冠心病模型建立成功。造模成功后，参考文献给药剂量[9]，伊伐布雷定低、高剂量组大鼠分别按照10 mg/kg、20 mg/kg的伊伐布雷定灌胃给药，对照组和模型组大鼠同时给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续给药4 周后进行后续实验。

1.3.2 超声成像系统检测心功能指标 末次给药后第2 d，使用 20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，采用小动物超声成像Vevo2100系统(Visual Sonics公司)检测大鼠的超声心动图，测定指标包括射血分数(Ejection Fraction，EF)、左心室缩短分数(Fraction Shortening，FS)、左心室舒张期内径(Left Ventricular End-Diastolic Dimension，LVDD)和左心室收缩期内径(Left Ventricular Internal Dimension Systole，LVDS)。

1.3.3 酶联免疫吸附测定 心功能检测结束后，打开大鼠腹腔，腹主动脉采集血液，在4 ℃低速离心机中以 4000 r/min 离心 5 min，取上层血清，用酶联免疫分析仪测定丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)和脑钠肽(BNP)水平，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 HE 染色 将大鼠主动脉弓和心肌组织用4%多聚甲醛进行固定，修剪包埋，浸于梯度乙醇进行脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，制成4 μm 的石蜡组织切片，苏木精染色 5 min，流水冲洗后，伊红染色液染色3 min，无水乙醇脱水，二甲苯中透明，中性树胶封片，于光学显微镜下观察并采集图片，观察斑块横截面和心肌组织的病理特征。

1.3.5 Masson 染色 将心肌组织石蜡切片脱蜡至水，用weigert氏苏木溶液染处理10 min，1%盐酸乙醇分化1 min，蒸馏水冲洗25 min，丽春红酸性品红液染色10 min，l%磷钼酸水溶液分化5 min，2%亮绿染液染5 min，1%冰醋酸水溶液浸洗1 min。随后分别用95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯中透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察心肌间质胶原纤维的表达情况，红色为心肌组织，蓝色为胶原纤维组织。

1.3.6 免疫组化染色 将心肌组织石蜡切片脱蜡至水，采用0.01 mol/L枸椽酸盐缓冲液进行抗原修复，3% H2O2溶液去除内源性过氧化物酶，10%羊血清室温封闭30 min，分别滴加一抗抗体TIMP-1(1∶100)、collagen Ⅰ(1∶200)和collagen Ⅲ(1∶200)，在4℃下孵育过夜。次日，PBS 冲洗，滴加对应的二抗抗体室温孵育30 min。PBS 再次冲洗，滴加DAB 显色，经复染、脱水、透明后，中性树胶封片，在电子显微镜下观察并进行图像采集，免疫组化染色后阳性细胞呈棕色至棕褐色着色。

1.3.7 Western blot检测 将心肌组织剪碎并加入RIPA 裂解缓冲液进行裂解，提取组织总蛋白，BCA 法进行蛋白浓度测定，电泳。10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，切胶并转移至PVDF膜，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗抗体TIMP-1(1∶1000)、Cleaved-Caspase3(1∶1000)、Bcl-2(1∶500)和Bax(1∶500)，以GAPDH(1∶5000)抗体为内参，在4℃下孵育过夜。次日，TBST 漂洗 PVDF膜，将PVDF膜与HRP 标记的二抗常温孵育 1 h，TBST 洗膜后，滴 ECL 发光液进行曝光，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白质灰度值。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 造模12周后，对照组大鼠表现出规则的窦性心律，见图1。与对照组比较，模型组大鼠的心电图中观察到不规则的窦性心律，ST段明显升高，说明造模成功。在药物治疗后，各组大鼠超声心动图检测结果，见图2A。与对照组比较，模型组大鼠EF、FS均显著下降，LVDD和LVSD显著增加(P<0.05)；经过高、低剂量伊伐布雷定作用的大鼠，EF和FS较模型组显著升高，LVDD和LVSD较模型组显著减小(P<0.05)，见图2B。

图1 两组大鼠心电图检测结果

图2 超声成像系统检测各组大鼠心功能相关指标

2.2 各组大鼠血清MDA、SOD、BNP水平比较 与对照组比较，模型组大鼠血清MDA浓度显著升高，SOD活性显著降低，BNP水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，伊伐布雷定低剂量组和伊伐布雷定高剂量组大鼠血清MDA浓度显著降低，SOD活性显著升高，BNP水平显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清MDA、SOD、BNP水平比较

2.3 各组大鼠主动脉弓与心肌组织HE染色结果 对照组大鼠的血管内膜中没有形成斑块，而模型组斑块面积较大，所占比例较高；伊伐布雷定低、高剂量组中斑块面积比例较模型组显著下降，见图3。

图3 HE染色检测各组大鼠主动脉中的病理学变化(20×)

心肌组织HE染色结果显示，对照组大鼠心肌纤维紧密、有序排列，心肌细胞大小均匀，无明显炎症细胞浸润现象；模型组大鼠心肌纤维较大，排列紊乱，心肌细胞肥大、变性和坏死，出现大量炎性细胞的浸润；伊伐布雷定低、高剂量组大鼠经伊伐布雷定给药后，大鼠心肌纤维结构完整，心肌细胞排列较为规则，病变现象得到明显的改善，见图4。

图4 HE染色检测各组大鼠心肌组织病理学变化(200×)

2.4 各组大鼠心肌组织Masson染色结果 Masson染色结果显示，对照组大鼠心肌细胞排列整齐，间质有少量的胶原纤维；模型组大鼠心肌细胞肥大、排列紊乱，数目减少，并出现大量的蓝色胶原纤维；伊伐布雷定低、高剂量组大鼠心肌细胞较为完整，有较少的蓝色胶原纤维，且高剂量组比低剂量组的胶原纤维化程度轻，见图5。

图5 Masson 染色检测各组大鼠心肌组织胶原纤维化程度(200×)

2.5 各组大鼠心肌组织TIMP-1免疫组化染色结果 免疫组化染色检测TIMP-1表达的结果显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织有大量棕褐色着色，TIMP-1阳性表达率显著增加(P<0.05)；与模型组比较，经过伊伐布雷定低、高剂量治疗后，两组大鼠心肌组织中棕褐色着色减少，TIMP-1阳性表达率显著减少(P<0.05)，见图6、表2。

图6 免疫组化染色检测各组大鼠心肌组织TIMP-1表达(100×)

2.6 各组大鼠心肌组织collagen Ⅰ和collagen Ⅲ免疫组化染色结果 免疫组化染色检测collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表达结果显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织出现较深的棕褐色染色，collagen Ⅰ和collagen Ⅲ阳性表达率均显著增加(P<0.05)；伊伐布雷定低、高剂量组大鼠心肌组织中染色变浅，collagen Ⅰ和collagen Ⅲ 阳性表达率较模型组显著减少(P<0.05)，见图7、表2。

图7 免疫组化染色检测各组大鼠心肌组织collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表达(200×)

表2 各组大鼠心肌组织TIMP-1、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ 阳性表达率

2.7 各组大鼠心肌组织TIMP-1、Cleaved-Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中TIMP-1蛋白相对表达量显著升高，而经伊伐布雷定低、高剂量治疗的两组大鼠心肌组织中，TIMP-1蛋白相对表达量较模型组显著降低(均P<0.05)；与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中Cleaved-Caspase3和Bax蛋白相对表达量显著升高，而 Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，伊伐布雷定低、高剂量组心肌组织中Cleaved-Caspase3和Bax蛋白相对表达量显著下降，Bcl-2蛋白相对表达量显著增加(P<0.05)，见图8。

图8 Western blot检测各组大鼠心肌组织TIMP-1、Cleaved-Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白表达

3 讨论

冠心病作为典型的复杂疾病，发生、发展主要在于遗传和环境因素的失调。高脂肪、高热量、高血压和高胆固醇以及糖尿病、吸烟、缺乏体育锻炼、饮食不良以及精神紧张等都可能导致冠心病的发生[10-12]。伊伐布雷定作为一种抗心律失常的药物，目前的研究已显示，其治疗后可降低因心脏症状而导致的死亡现象。Chen等[13]的研究发现，伊伐布雷定可明显减轻糖尿病小鼠的心肌细胞凋亡和心脏功能障碍。Zuo等[14]的报道指出伊伐布雷定通过抑制JNK/p38 MAPK通路介导的炎症和凋亡，从而发挥在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠心脏功能中的保护作用。本研究通过高脂饲料喂养联合注射维生素 D3构建冠心病大鼠模型，通过检测发现造模大鼠出现EF和FS下降、LVDD和LVSD增加的现象，并且心肌组织结构紊乱，心肌细胞肥大、变性及坏死，以上结果均说明冠心病大鼠模型构建成功，大鼠心肌组织受到了一定程度的损伤。而经过伊伐布雷定治疗后，大鼠EF和FS升高，LVDD和LVSD减小，心肌组织损伤情况得到了明显的改善。

心肌纤维化是指冠状动脉长期狭窄后，导致的心肌缺血缺氧、心肌细胞肥大或萎缩，以及间质纤维增生的现象[15-17]。研究表明，心肌纤维化程度是预测不良心脏预后的重要指标。冠心病动脉粥样硬化严重的心肌损伤过程是心肌纤维化和心肌细胞凋亡两者结合的作用结果[18]。心肌细胞的凋亡会导致心肌收缩功能丧失，在冠心病进展中具有至关重要的作用，抗心肌细胞凋亡也是冠心病潜在的治疗策略之一。已报道指出细胞凋亡会导致纤维化现象的发生[19]。因此诱导心肌再生、逆转心肌组织纤维化和促进受损心脏功能恢复成为冠心病治疗的重要目标。本研究结果显示，经过伊伐布雷定治疗的大鼠心肌组织纤维化程度明显减小，同时，心肌组织内collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表达减少，促凋亡蛋白Cleaved-Caspase3和Bax的表达量下降，抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量增加，说明伊伐布雷定能够抑制心肌组织纤维化和心肌细胞凋亡，从而起到心肌保护的作用。

TIMP-1作为基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的抑制剂，由多种类型的细胞表达，并存在于大多人体组织和体液中[20-21]。MMP1和TIMP1之间的水平平衡控制着细胞周围局部细胞外基质降解的程度，从而影响细胞的迁移、增殖和存活等过程[22]。此外，TIMP-1具有独特的肿瘤刺激功能，如TIMP-1过表达可能通过VEGF促进肿瘤血管发生，促进浸润转移，乳腺癌中TIMP-1过表达和预后不良相关[23-25]。在本研究中，冠心病大鼠心肌组织中TIMP1出现异常高表达，经过伊伐布雷定治疗后抑制了 TIMP1的表达，这可能是其作用机制之一。

4 结论

伊伐布雷定对冠心病大鼠的心脏保护作用可能与抑制心肌细胞凋亡，改善组织学异常和组织纤维化，抑制TIMP-1的异常高表达等相关。