大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核内COX2过表达与牙正畸痛的相关性*

牛乐 岳江涛 冯凯隆 梅江涛 贾晓康 戴先文

(西安市长安医院骨科，陕西 西安 710016)

约95%的正畸患者在牙移动后出现正畸痛，近35%的正畸患者正畸痛持续迁延，经久不愈[1-2]。正畸痛严重影响患者的预后及生活质量，阐明其发病机制迫在眉睫[3-4]。环氧合酶 (Cyclooxygenase,COX)其同功酶有三种亚型：COX1、COX2及COX3。中枢神经COX2对于神经病理性痛的调节作用至关重要[5-6]。越来越多学者认为，脊髓和大脑的病理性改变决定了正畸痛的诱导和维持[7-8]。目前认为在三叉神经脊束核尾侧亚核 (Trigeminal Nucleus Caudalis，Vc)出现的突触可塑性改变和中枢敏化是正畸痛产生和维持的重要机制[9-11]。以往研究鲜少报道中枢COX2与正畸痛的相关性。本实验以大鼠正畸痛模型为工具，以Vc为靶点，综合运用各种实验方法探讨Vc内COX2的表达变化以及与正畸痛的相关性，旨在从全新的角度探寻正畸痛的病理生理机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性清洁级SD大鼠24只，体重200～220 g，均购自于西安空军军医大学实验动物中心，本实验操作均遵循Zimmermann教授有关善待动物的伦理学条例[12]，并经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 大鼠随机分为实验性牙正畸痛组(Experimental Tooth Movement Pain,ETMP组)，假手术对照组(Sham组)和空白对照组(Naive组)，每组8只。

1.2.2 实验设计

1.2.2.1 每组在造模前和造模后4 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d先进行痛觉行为学检测，然后利用免疫组化染色、免疫荧光染色和Western blot检测Vc内COX2的表达变化。

1.2.2.2 在痛觉阈值最低时间点，鞘内注入各种环氧合酶抑制剂进行行为药理学检测，同时在Vc进行免疫荧光双重染色。

1.3 动物模型的建立

1.3.1 ETMP组 大鼠有16颗牙齿，分上颌左+上颌右+下颌左+下颌右总共4个区，每区有1颗切牙和3颗磨牙，在上颌左+上颌右2个区，先在第一切牙与第一磨牙分别套上微型橡皮筋，然后利用微型弹簧连接2个橡皮筋进行牵拉，注意套上微型橡皮筋及微型弹簧时防止损伤到牙周组织，实景图见图1A ，不同时间点进行痛觉行为学检测[13-15]。

1.3.2 Sham组 造模过程同ETMP组，只在第一切牙与第一磨牙分别套上微型橡皮筋，不用微型弹簧连接。

1.3.3 Naive组 大鼠未经任何处理。

1.4 痛行为学检测 提前将大鼠置于背景噪声为45 db的房间内适应环境30 min，然后将大鼠置于一个透明的塑料笼子里(45 cm×45 cm×45 cm)，笼内有被褥和摄像头。所有大鼠在开始记录前至少适应15 min的测试环境，对大鼠的面部搔抓活动进行10 min的录像记录，连续记录三次，取三次记录的平均值，得出每只动物的记录值[13-15]。

1.5 形态学

1.5.1 切片制备 深麻大鼠，插管至主动脉，先以磷酸缓冲液(PB)快速冲洗血液，再以4%多聚甲醛灌注固定。随后切取延髓，移入30%蔗糖的PB过夜。恒冷切片机切片，片厚25 μm。

1.5.2 免疫组化及免疫荧光染色 0.01 M 磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗切片3次，兔抗COX2 (Chemicon)室温下孵育过夜；FITC荧光标记的二抗或生物素化的二抗室温孵育6 h；FITC荧光标记的切片用荧光显微镜观察；针对生物素标记的切片，A、B液混合后(Vector，1：200)孵育切片2 h，各免疫反应步骤之间均用PBS漂洗，最后以0.05%DAB呈色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，普通显微镜观察。

1.5.3 免疫荧光双标染色 漂洗切片, 兔抗COX2分别与羊抗Fos (Santa Cruz), 小鼠抗NeuN (Chemicon)共同孵育；漂洗,入荧光二抗；漂洗，裱片，封片；激光共聚焦显微镜观察。

1.6 Western blot检测 腹腔注射1%戊巴比妥钠(60 mg/kg)深麻醉大鼠，冰上处死后取出延髓组织；用RIPA法裂解组织提取总蛋白，进行蛋白定量；制备SDS-PAGE胶，上样电泳；电泳结束后将蛋白样品由凝胶转至PVDF膜，以抗COX2的一抗4℃孵育过夜；次日复温1 h后以相应的二抗37℃孵育40 min；加入化学发光剂后，暗室曝光，得到COX2和β-actin条带；通过与β-actin条带对比的相对灰度值比较各组样品之间蛋白的表达差异。

1.7 行为药理学

1.7.1 脑室内置管 参照以往方法，用甲氧氟烷气体快速麻醉大鼠，将大鼠置于立体定向框架上，在延髓背侧植入聚乙烯管(PE10)，聚乙烯管末端深达蛛网膜下腔，此方法已在国际公认，经导管注入药物后，可有效作用于Vc[16]。

1.7.2 给药 ETMP组痛觉阈值最低时间点，鞘内给药SC-560 (COX1选择性抑制剂)，NS-398 (COX2选择性抑制剂)，indomethacin (COX非选择性抑制剂) 或acetaminophen (COX3选择性抑制剂)，溶剂对照组给予相当量的溶剂，观察镇痛效果。

2 结果

2.1 ETMP组大鼠形成了正畸痛，并且Vc内COX2染色密度显著增加 Sham组和Naive组没有出现痛觉行为学表现，即面部搔抓时间在各个时间点都处于基准水平，见图1B。与Sham组[(9.1±1.2)s]和Naive组[(10.0±1.3)s]相比，ETMP组在牙移动后4 h[(17±3.6)s]形成了显著的痛觉行为学表现，即面部搔抓时间显著增加，并且在1 d[(35±6.7)s]时达到巅峰(P<0.05)，见图1B。随后痛觉过敏开始逐渐减退，并且在第7 d[(10.1±1.5)g]时痛觉过敏接近消失，恢复到正常水平。与Sham组相比，ETMP组Vc内COX2的免疫组化染色密度出现了显著增加，见图1C。

图1 ETMP组大鼠形成了正畸痛，且Vc内COX2染色密度显著增加

2.2 ETMP组Vc内COX2的表达显著提高，并且与痛觉行为学密切相关 Western blot检测显示，与Naive组(0.1±0.005)和Sham组(0.1±0.01)相比，ETMP组Vc内COX2的蛋白表达水平在牙移动后4 h(0.35±0.06)出现了显著提高，COX2表达的增加在牙移动后1 d(0.6±0.07)达到巅峰(P<0.05)，见图2A。随后COX2表达的增加开始逐渐减少，并且在第7 d(0.18±0.04)时恢复到基准水平； ETMP组COX2的表达变化与痛觉行为学(面部搔抓时间)呈显著的正相关 (P<0.001)，见图2B。这提示在正畸痛时，Vc内COX2的过表达有可能对于痛觉信息的调控至关重要。

图2 ETMP组Vc内COX2的表达显著提高，并且与痛觉行为学密切相关

2.3 ETMP组Vc内COX2由神经元生成，并且大部分COX2阳性神经元处于激活状态 ETMP组Vc内的免疫荧光染色密度出现了显著增加，COX2免疫阳性结构主要集中在VcⅠ-Ⅱ层(图3A～B)；在Vc内进行的免疫荧光双重染色显示，COX2免疫阳性结构只是存在于NeuN免疫阳性神经元(图3C～E)，大部分COX2阳性神经元为Fos 阳性(图3F～H)。

图3 ETMP组Vc内COX2由神经元生成，并且大部分COX2阳性神经元处于激活状态

2.4 Vc内COX2的过表达导致了正畸痛的产生 在ETMP组大鼠模型痛觉阈值最低的时间点1 d，相比溶剂对照组[(33.1±6.2)s]，经延髓背侧蛛网膜下腔给予NS-398[(17.2±3.2)s]能够产生明显的镇痛作用(P<0.05)。而给予SC-560 [(32.8±4.3) s]或acetaminophen[ (33.5±5.5)s]对于痛觉阈值没有任何影响，见图4。这提示在正畸痛时，Vc内COX2的过表达导致前列腺素等炎性介质的大量生成，最终增强疼痛信号的传递，导致异常疼痛的形成。

图4 Vc内COX2的过表达导致了正畸痛的产生

3 讨论

正畸治疗通过对错位的牙、牙弓或颌骨施加一定的矫治力来达到矫治畸形的目的。疼痛使患者惧怕正畸治疗，甚至放弃治疗。随着患者对治疗舒适度要求的增加，认识正畸治疗中的疼痛特点，寻找正畸疼痛发生及变化的规律，有效地减轻或防止治疗过程中的疼痛，成为正畸医师关注的研究热点[1-4]。以往对正畸痛的研究都集中在牙周组织的病变，而本实验率先提出中枢延髓水平COX2的过表达导致了正畸痛的产生，以期能够在中枢神经水平对正畸痛进行有效的干预和治疗，为正畸痛的预防治疗提供了一个新的靶点。

以往学者在大鼠上颌第一切牙与第一磨牙之间利用微型弹簧连接，成功建立了实验性大鼠正畸痛模型，该模型大鼠在牙移动后形成了显著的痛觉行为学表现，即面部搔抓时间显著增加，且痛觉程度、时程与临床正畸痛患者极为相似，因而该模型认为是研究正畸痛的理想动物模型[13-15]。本实验成功复制了该模型。先在第一切牙与第一磨牙分别套上微型橡皮筋，然后利用微型弹簧连接2个橡皮筋进行牵拉，ETMP组在牙移动后4 h面部搔抓时间显著增加，并且在1 d时达到巅峰，随后痛觉过敏开始逐渐减退。而临床上大部分正畸痛患者在正畸后1 d时最痛，1周后疼痛逐渐减轻，这说明本研究实验动物其痛觉表现与临床实际情况极为相似，是研究正畸痛的理想动物模型。

传统观点认为，正畸时牙周神经末梢受到机械或化学刺激是正畸痛发病的主要原因，但越来越多的学者认为周围神经病变不能完全解释正畸痛的发生、发展过程，脊髓和大脑的病理性改变更多地决定了正畸痛的诱导和维持[7-8]。有学者利用功能性磁共振成像发现正畸痛患者Vc，前扣带回皮质等与中枢痛觉信息调控密切相关的核团或脑区处于过度代谢和激活状态[17-18]。

COX是合成前列腺素过程中的重要限速酶。COX2为诱导型COX，参与机体的各种病理应激反应，广泛分布于脊髓和大脑，中枢COX2对于神经病理性痛的调节作用越来越得到研究者的关注[5-6, 19]。

Vc作为头面部痛觉信息传递调控的闸门，具有关键作用[10-11]，故本实验从新的切入点，即延髓Vc水平，探讨和研究正畸痛的发病原理。本研究结果显示，正畸痛大鼠Vc内COX2的染色密度和蛋白表达水平显著提高，COX2的表达上调和痛觉阈值的减低(面部搔抓时间显著增加)呈显著相关，鞘内给予COX2的特异抑制剂能产生明显的镇痛作用。

在本实验中，ETMP组经延髓背侧蛛网膜下腔给予NS-398 能够产生明显的镇痛作用，而给予SC-560 或acetaminophen对于痛觉阈值没有任何影响。这提示延髓COX1或COX3并没有参与ETMP组疼痛的形成和维持，只有COX2参与了正畸痛的形成和维持。免疫荧光组织化学双重染色显示，COX2由Vc浅层内激活的神经元细胞生成。以上实验结果从全新的角度诠释正畸痛的病理生理机制，为临床诊疗正畸痛提供新的理论依据。

4 结论

本研究以大鼠正畸痛模型为工具，以Vc为靶点，综合运用药理行为学、形态学和分子生物学等方法研究Vc内COX2的表达变化以及与正畸痛的相关性，从全新的角度探寻正畸痛的病理生理机理。Vc内COX2的上调参与了ETMP大鼠痛觉行为学的形成，这一结果发现对指导新型镇痛药物的研发和正畸痛的治疗等方面，都将具有积极的促进作用。