环状RNAcirc-ccnb1通过抑制细胞周期蛋白核转位对食管鳞癌增殖和迁移的影响*

杨瑜 刘耀河 秦宁 谭柳 宋锐 侯歌 袁金金 张艳 刘宗文

(1.郑州大学第二附属医院放射治疗科，河南 郑州 450014；2.郑州大学基础医学院药理学教研室，河南 郑州 450014)

食管癌是目前临床最为常见的恶性肿瘤之一，预后效果差，5年生存率通常低于20%[1]。肿瘤细胞多通过单克隆或多克隆进行复制，有丝分裂是肿瘤细胞增殖所需要的关键步骤[2]。Ccnb1是细胞有丝分裂的调节因子[2]，在许多癌症中都有较高水平的表达[3]。Ccnb1与肿瘤的侵袭能力有密切关联[4]，即在核内Ccnb1表达水平较高的细胞，其侵袭能力较强。目前有研究表明，在多种肿瘤疾病中，环状RNA cir-ccnb1可以通过抑制ccnb1的功能影响肿瘤的发展，但在食管癌中报道鲜少。本研究通过免疫组化实验，检测ccnb1在食管癌组织中的表达量，并通过增殖、划痕实验，探讨cir-ccnb1对 ccnb1的功能以及对食管癌细胞增殖、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 组织、细胞来源

1.1.1 组织来源 收集郑州大学第二附属医院2014～2015年收治的60例患者手术切除的食管鳞癌标本以及癌旁正常食管粘膜组织标本。入组条件：①术前有接受过放疗或化疗的，均排除。②术式不能选择根治术的均排除。选取标本：男性42例，女性18例；65岁以上(含65岁)32例，65岁以下28例。Ⅰ、Ⅱ期32例，Ⅲ、Ⅳ期28例；淋巴结转移31例，无转移29例。

1.1.2 细胞系 正常食管上皮细胞(Het1-A)和食管鳞癌细胞(EC109)均由郑州大学基础医学院馈赠。

1.2 免疫组化与蛋白免疫印迹

1.2.1 免疫组化 新鲜标本进行多聚甲醛固定，过夜后石蜡包埋，切成3 μm厚度切片。石蜡切片进行脱蜡、水化，抗原修复后阻断内源性过氧化物酶，封闭。37 ℃下湿盒中孵育，取出恢复至室温。应用生物素标记山羊抗小鼠IgG孵育。滴加辣根过氧化酶标记链霉卵白素工作液。DAB进行显色，镜下观察染色分化、返蓝后进行脱水，中性树脂封片，200倍镜下观察。随机选取5个视野，计细胞数500个进行评分。评分标准：①不显色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，褐色3分。②阳性细胞<5%为0分，5%为1分，10%为2分，50%为3分，75%为4分。将①与②相加后，<6分为低表达，≥6分为高表达。评分由两名病理专家采取双盲法进行评价，若结论不一致则增加一名病理医师进行评价[5]。

1.2.2 蛋白免疫印迹 检测食管癌细胞中ccnb1的表达，分别取对数生长期的Het1-A和EC109，将细胞分别种于6孔板，每孔2×105个 /mL，当生长达到90%左右时，应用EDTA消化细胞，洗涤2次，裂解细胞后刮下细胞碎片，完成收集超声裂解，离心提上清， BCA法测浓度，每孔25 μg加样，恒压90 V浓缩胶电泳再用120 V恒压分离胶电泳。250 mA恒流转膜，封闭非特异抗体，按抗体稀释浓度1∶2000(ccnb1)，1∶2500(β-actin)。室温下孵2抗2 h，ECL显色液进行显色并暗示中曝光，实验重复3次。应用软件Image J1.48进行定量分析，计算目的条带与内参条带比值来评估蛋白表达水平。

1.3 过表达circ-ccnb1后对EC109生物学行为的影响

1.3.1 实验分组 将EC109细胞分3组进行实验： Blank组、Vector组及circ-ccnb1组，分别取对数生长期的EC109细胞种于6孔板，每组有3个复孔，每孔种植细胞为2×105个 /mL。24 h后对Vector和circ-ccnb1组分别应用lipofectmine3000转染携带空载体和cir-ccnb1的质粒，饥饿转染6 h，然后换为完全培养基。

1.3.2 核浆分离 按核浆分离试剂盒说明书进行核浆分离及核质裂解、收集细胞核蛋白等相关步骤操作，对提取的核蛋白分别进行定量以及煮样，然后进行SDS-PAGE电泳测量蛋白的表达量，来衡量ccnb1蛋白的核转位的量。以增殖细胞核抗原(PCNA)作为核内蛋白内参，抗体稀释浓度1∶2000。

1.3.3 细胞增殖能力检测 按照上述处理细胞方法将细胞分别种植于96孔板，每孔2×103个细胞，加入100 μL培养基培育72 h后，加入10 μL CCK8溶液于37 ℃温度下避光孵育2 h，测算530 nm处吸光值(A)，应用公式：细胞增殖率=实验组A/空白对照组A×100%，计算出细胞增殖率。重复3次实验。

1.3.4 细胞迁移率检测 同样按照上述处理细胞方法将细胞分别种植于6孔板，待细胞生长至以单层形式铺满孔底后，使用200 μL的枪头进行划痕，磷酸缓冲盐溶液清洗后，每孔滴加2 mL 2%的胎牛血清培养液，拍照0、24 h的细胞迁移状况，用Image J1.48计算细胞迁移率，计算方法：首先计算划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕愈合宽度)/0 h划痕宽度；然后计算迁移率=实验组愈合率/空白对照组愈合率。重复实验3次。

2 结果

2.1 免疫组化检测食管癌及癌旁正常粘膜组织中ccnb1的表达 对食管鳞癌组织和癌旁正常粘膜组织进行免疫组化，见图1。ccnb1蛋白的表达在食管鳞癌中高于正常粘膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1 食管鳞癌组织和癌旁正常粘膜组织中ccnb1的表达情况(200 ×)

表1 ccnb1蛋白在食管鳞癌组织及癌旁正常粘膜组织中的表达情况

2.2 食管鳞癌中ccnb1表达与临床病理的关系 对免疫组化的结果进行临床病理分析，ccnb1蛋白的高表达与患者的性别、年龄无相关性(P>0.05)，与食管癌的淋巴结转移及病理分期有关(P<0.05)，见表2。

表2 食管鳞癌中ccnb1表达与临床病理参数的关系

2.3 Het1-A与EC109中ccnb1表达水平的比较 Het1-A组中ccnb1的表达水平(0.67±0.14)低于EC109组(1.01±0.06)，两组差异有统计学意义(t=-3.912，P=0.017)，见图2。

图2 Het1-A与EC109中的ccnb1的表达水平

2.4 过表达circ-ccnb1后ccnb1在核内水平的变化 与Blank组和Vector组相比， circ-ccnb1组细胞核的ccnb1蛋白表达明显降低(P<0.05)。与Vector组相比， circ-ccnb1组细胞的增殖率、迁移率降低(均P<0.05)，见图3、表3。

表3 Ccnb1核转位水平、细胞增值率、细胞迁移率的比较

图3 3组细胞的ccnb1核转位水平

3 讨论

环状RNA是一大类单链RNA，属于非编码RNA，具有广泛的表达模式[6-8]。已知许多环状RNA在癌症的发展中发挥作用[9]。Circ-RNA表达谱在哺乳动物间具有保守性[10]。通过对小鼠和人类细胞RNA测序数据的全基因组分析，揭示了环状RNA的进化保守性，提示其在细胞生理学中的具体作用[11-12]，由于其稳定性的提高，环状RNA可能比线性RNA更有效[13]。考虑到环状RNA的丰富度和进化保守性，其可能具有潜在的调节作用[14-15]。环状RNA在细胞质中高度表达，且含有多个microRNA(miRNA)结合位点，有可能具有抑制miRNA活性的功能[16]。Du等[17]发现，circ-RNA不仅与蛋白质结合，还调控蛋白质的核转位，影响细胞增殖。cir-ccnb1是来源于ccnb1基因的外显子4和外显子5，cir-ccnb1在癌组织中的含量显著低于正常组织[7]，这就有可能说明cir-ccnb1是抑制肿瘤发展的一个因素。

环状RNA对肿瘤相关疾病有着广泛的研究前景。有研究发现，某些circ-RNA可以通过与蛋白质结合来掩盖其结合位点，抑或作为竞争物阻断蛋白质的生物学功能[18]。目前对circRNA的研究主要集中在其作为有效分子海绵的功能上[19]。有研究发现，circRNA作为一种新的生物标志物具有巨大的潜力，并为早期诊断提供了新的思路[20]。对于其中circ-ccnb1相关的研究来说，Yang等[21]研究表明，环状RNA 可以通过参与蛋白质翻译过程进而影响肿瘤发展。值得注意的是，它还与多种信号通路转导的因子具有相互作用，通过某几个结合位点与之结合[22]。降低ccnb1诱导的有丝分裂活动是一种新机制，是研究出新的干预癌症进展的关键[22]。本研究中免疫组化实验发现，食管鳞癌组织中ccnb1的高表达与患者的淋巴结转移及病理分期关系密切。据李丽等[23]报道，ccnb1在食管鳞癌发生、发展过程中呈高表达，这与本研究结果一致。通过研究食管鳞癌细胞上circ-ccnb1对ccnb1可产生作用，发现它可以抑制该蛋白的核转位，阻止其功能的发挥，这就抑制了肿瘤细胞的有丝分裂，从而抑制了食管鳞癌细胞的增殖、迁移。

Fang等[22]通过动物实验，探讨了circ-ccnb1作为癌症治疗药物的可能性，并且取得了良好的效果。这些研究是具有突破性意义的，为circ-ccnb1的研究提供了广阔的临床应用的前景。针对ccnb1的生物作用，应用circ-ccnb1很可能会成为治疗癌症的一种新药物或新手段。同时由于circ-ccnb1对肿瘤的抑制作用，它的表达水平的高低也可能作为判断患者预后的潜在指标。

4 结论

cir-ccnb1可以通过抑制ccnb1在食管鳞癌细胞中的核转位抑制食管鳞癌的发展，即抑制其增殖和迁移，但尚不能证明年龄、性别存在差异性。