水飞蓟宾对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad3信号通路的调节作用*

李燕菊 冯杰 韩忠诚 赵婷 李红健 马俊鹏 孙力 玛尔江·巴哈提别克 王燕 于鲁海

(1.新疆维吾尔自治区人民医院药学部, 新疆 乌鲁木齐 830001；2.新疆维吾尔自治区临床药学研究所，新疆 乌鲁木齐 830001；3.新疆维吾尔自治区人民医院肿瘤科，新疆 乌鲁木齐 830001)

肝纤维化是肝脏长期处于炎症损伤状态并进展为肝硬化的一种病理生理过程，如不及时干预，可能会并发腹水、肝性脑病、肝肾综合征等全身多组织器官病变，甚至会进展为肝癌等严重疾病[1-2]。水飞蓟宾为从菊科植物水飞蓟[Silybummarianum(L.) Gaertn.]中提取得到的一种天然产物，具有抗炎、抗病毒等作用[3]。近年来有文献报道[4]，水飞蓟宾在肝纤维化的临床治疗中表现出显著疗效。本研究通过探讨水飞蓟宾对肝纤维化大鼠的作用及机制，旨在为水飞蓟宾在肝纤维化治疗中的药理作用机制提供依据，并为水飞蓟宾的临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠45只，6～8周龄，体重180～200 g，购买于新疆医科大学实验动物中心，饲养于实验动物房，动物房温度保持在20～24 ℃，湿度为40%～60%。本实验经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准，符合动物试验伦理学要求。

1.2 药品及试剂 水飞蓟宾(北京索莱宝科技有限公司，货号：IS0160，纯度>98%)；硫代乙酰胺(北京索莱宝科技有限公司，货号：T8700，纯度>98%)；Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：G1340)；酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒HA(上海信裕生物科技有限公司，货号：CEA182Ge)、PCⅢ(上海雅吉生物科技有限公司，货号：YS03777B)、LN (上海和序生物科技有限公司，货号：EK0435)、ColⅣ酶ELISA检测试剂盒(默瑞生物科技有限公司，货号：KT-32025)；RIPA蛋白裂解液(货号：P0013B)、超敏ECL化学发光试剂盒(货号：P0018M)、TGF-β1兔单克隆抗体(上海联迈生物工程有限公司，货号：LM-0086R)；Smad3、GAPDH兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (上海碧云天生物科技有限公司，货号：AF1501、AF1186、A0208)；苏木素染液、伊红染液(北京诺博莱德科技有限公司，批号：ZLI-9610、ZLI-9613)。

1.3 仪器及设备 Axio Imager M2M倒置显微镜(德国卡尔蔡司公司)；TG18-WS台式高速冷冻离心机(湖南湘鑫仪器仪表有限公司)；Varioskan LUX多功能酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)；ChemiDoc XRS型凝胶成像仪(美国伯乐生命医学有限公司)；S700半自动石蜡切片机(瑞沃德生命科技有限公司)；DYCZ-24DN双垂直电泳槽(山东博科再生医学有限公司)；SD1-BS全自动生化分析仪(成都斯马特科技有限公司)。

1.4 肝纤维化大鼠模型的建立 45只大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组及水飞蓟宾组，每组15只。参照文献方法[5-6]，除对照组外，其余大鼠按照200 mg/kg腹腔注射给予硫代乙酰胺，隔天1次，连续给予7周，对照组大鼠腹腔注射给予等量生理盐水。造模结束后随机抽取3只大鼠，麻醉后取肝组织，并采用HE染色法检查肝组织病理学变化，以大鼠血清清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)水平显著高于对照组，同时肝组织出现明显病理学改变视为造模成功。水飞蓟宾组根据体重按照75.6 mg/kg的剂量灌胃给予大鼠水飞蓟宾[7-8]，对照组及模型组灌胃给予等量生理盐水，1次/d，给药6周[8]。

1.5 各组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平检测 大鼠末次给药24 h后，眼眶后静脉丛取血至离心管中，4℃静置4 h，以4℃，3500 rpm离心10 min，取上清液，使用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平。

1.6 各组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平检测 腹腔注射给予10%水合氯醛(3 mL/kg)对大鼠麻醉后固定，取仰卧位，腹主动脉取血至离心管，4℃静置4 h，3500 rpm离心10 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)及Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)水平。

1.7 各组大鼠肝组织病理学检查 大鼠处死后分离肝组织， 10%中性甲醛中固定24 h，脱水、透明处理后，浸蜡、包埋、 5 μm切片，将石蜡切片依次经过脱蜡、复水、苏木精染色、分化、伊红染色等步骤进行常规苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色)及Masson染色，在显微镜下进行组织病理学检查。

1.8 Western blot检测大鼠肝组织TGF-β1、Smad3水平 取各组大鼠肝组织，在玻璃匀浆器中加入RIPA蛋白裂解液进行匀浆，以4 ℃，12000 rpm离心10 min，取上清液，加入上样缓冲液，混匀后置于100 ℃水浴5 min变性。BCA法测定蛋白浓度后，取50μg蛋白进行电泳分离，经转膜、封闭液封闭后，TGF-β1、Smad3及GAPDH抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜。磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(1∶1000)室温孵育1 h，PBST再次清洗3次，凝胶成像仪成像后，使用Image J 1.52v软件进行灰度值检测及分析。

2 结果

2.1 大鼠ALT、AST、ALP及GGT水平 模型组肝纤维化大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平较对照组升高(P<0.05)；与模型组比较，水飞蓟宾组血清ALT、AST、ALP、GGT水平降低(P<0.05)，见表1。

表1 大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平

2.2 大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平比较 模型组肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平较对照组升高(P<0.05)；与模型组比较，水飞蓟宾组HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平降低(P<0.05)，见表2。

表2 大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平

2.3 大鼠肝组织病理学检查 对照组大鼠肝组织细胞形态结构正常，肝组织未见明显病理学变化；与对照组比较，模型组大鼠肝组织细胞排列不整齐，部分细胞坏死、脱落，存在胶原沉积，胆管增生，纤维组织增多，中心静脉轻度扩张充血，提示造模成功；与模型组比较，水飞蓟宾组大鼠肝组织病理学变化出现不同程度的改善，水飞蓟宾组大鼠肝组织细胞排列较整齐，中心静脉充血减轻，纤维组织减少。各组大鼠肝组织病理学检查结果，见图1～2。

图1 大鼠肝组织HE染色结果(200×)

2.4 大鼠肝组织TGF-β1、Smad3水平比较 模型组肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1、Smad3水平较对照组大鼠显著升高(P<0.05)；与模型组比较，水飞蓟宾组TGF-β1、Smad3水平降低(P<0.05)，见图3。

图2 大鼠肝组织Masson染色结果(200×)

图3 大鼠肝组织TGF-β1及Smad3蛋白水平

3 讨论

肝纤维化是由病毒性肝炎、自身免疫性疾病及药物性原因引起的肝组织细胞损伤，且诱发因素长期不能去除，导致肝组织细胞长期处于炎症状态，进而疾病进展为肝纤维化。腹腔注射硫代乙酰胺是目前实验室常用的建立肝纤维化动物模型的方法之一，并且具有方便、安全、造模成功率高等特点[9]。

水飞蓟宾是从植物水飞蓟的果实中提取得到的一种单体化合物，对肝炎、肝硬化等多种疾病具有一定的疗效[10]。刘凯南等[11]研究表明，水飞蓟宾联合常规治疗能够改善酒精性肝病患者的肝功能，抑制患者体内肝纤维化因子水平，且疗效优于常规治疗。陈伟平[12]报道了水飞蓟宾联合抗病毒药物替诺福韦能够降低慢性乙型肝炎患者肝硬度，缓解肝纤维化进展,这提示水飞蓟宾在肝纤维化的治疗中表现出巨大的潜力。

临床中常使用ALT、AST、ALP、GGT等指标评价肝功能，其水平的升高提示肝组织细胞受损及肝功能下降[13]。本实验结果表明，模型组肝纤维化大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平较对照组升高，提示造模成功，然而给予大鼠水飞蓟宾及秋水仙碱后，血清ALT、AST、ALP、GGT水平较模型组降低。在临床研究中发现肝纤维化患者体内HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平升高，提示HA、LN、PCⅢ、ColⅣ等因子均参与肝纤维化的过程[14]。本研究结果发现，水飞蓟宾能够显著降低肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平，进而缓解大鼠肝纤维化进展。

TGF-β1通路是参与细胞增殖分化及细胞动态平衡的重要信号通路[15-16]，Smad3是TGF-β1下游的重要信号基因[17]。TGF-β1的激活能够活化Smad3蛋白，并能够诱导和促进表达TGF-β1及Smad3组织器官的上皮间质转化和纤维化，在肺、肾、肝等器官的纤维化过程中尤为重要[18]。李文庭等[19]研究表明，乙型肝炎病毒诱导肝纤维化的过程与激活TGF-β1信号通路的过程相关；郭辉等[20]研究表明，肝纤维化与TGF-β1/Smads信号通路的异常激活密切相关，抑制TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的表达能够缓解肝纤维化的进展及预后。以上研究提示对于肝纤维化的治疗，抑制TGF-β1/Smads通路及其相关蛋白的异常激活可能具有重要作用。本实验结果表明，肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1、Smad3水平较模型组升高，给予大鼠水飞蓟宾后，大鼠肝组织TGF-β1、Smad3水平均降低，提示水飞蓟宾对肝纤维化大鼠的改善作用可能是通过调节TGF-β1/Smad3信号通路实现的。本研究证实，水飞蓟宾对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smads通路具有显著的调节作用，为水飞蓟宾在肝纤维化治疗中的作用机制提出新的证据。但未能深入探讨水飞蓟宾对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1/Smad3通路的靶向调节作用，拟在今后研究中进行深入探讨。

4 结论

水飞蓟宾能够明显改善硫代乙酰胺诱导的肝纤维化大鼠肝功能，抑制肝纤维化因子水平，改善大鼠肝组织病理学进展，其机制可能与调节TGF-β1/Smad3信号通路有关。