原发性免疫性血小板减少症患者骨髓TPO及c⁃mpl水平测定意义

2021-08-25黄菊卫仿仙韩艳霞沈闪华王宙政

实用医学杂志 2021年15期

黄菊卫仿仙韩艳霞沈闪华王宙政

1上海市公共卫生临床中心，复旦大学附属公共卫生临床中心（上海201508）；2嘉兴学院附属第二医院，嘉兴市第二医院（浙江嘉兴314000）

原发性免疫性血小板减少症（primary immune thromb ocytopenia，ITP）既往称之为特发性血小板减少性紫癜，是一种获得性孤立性血小板减少为特征的自身免疫性出血性疾病，约占成人出血性疾病的1/3。部分患者在诊断时可能无症状，也可能出现轻微的皮肤黏膜出血，有5%患者可能出现严重出血，甚至危及生命［1］。到目前为止ITP 诊断仍然是一种排他性诊断，其发病率在2 ～ 4 例/10万，有2 个发病高峰期，一个在20 ～ 30 岁之间，女性多发，另一个发病高峰期在60 岁左右，男女比例相当［2-3］。ITP 发病机制及病理生理仍然复杂，既往观点一致认为ITP 患者体内存在体液免疫异常，对自身血小板抗原免疫失耐受，患者体内产生针对血小板的自身抗体，血小板和自身抗体结合后在网状内皮系统被巨噬细胞吞噬，从而引起外周血血小板水平降低。但近年来更多证据表明ITP 不仅存在体液免疫异常，同时还存在细胞免疫功能异常，体液免疫和细胞免疫异常活化，共同介导血小板破坏加速及巨核细胞产生血小板不足。临床治疗手段很多，但疗效仍不确切，不同患者的治疗反应也不一样。并且不同治疗手段所带来的副反应以及给患者带来的经济负担，都是临床医生在作出治疗选择前所面临的挑战，目前尚缺乏一系列行之有效的预后判断因素，能够更为精准地选择治疗方案。本研究通过检测50 例ITP 患者及20 例脾功能亢进症患者和16 例骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓TPO 及其受体c⁃mpl 的水平，分析其在ITP 的诊断与鉴别诊断中的意义，同时通过不同治疗组中TPO 及c⁃mpl 表达水平情况判断在治疗反应评估中的意义。

1 资料与方法

1.1 病例资料选取我科2016年1月至2018年12月收治的50 例ITP 患者，其中女30 例（PLT ≥30 × 109/L 者12 例，< 30 × 109/L 者18 例），男20 例（PLT ≥30×109/L者8例，<30×109/L者12例），年龄15 ～ 89 岁，平均（43.32 ± 16.28）岁；其中PLT ≥30 × 109/L 组年龄（45.83 ± 2.45）岁，< 30 × 109/L组年龄（40.75±1.63）岁，根据血常规、骨髓细胞学等确诊，并完善抗核抗体、ANCA、血沉、免疫球蛋白、淋巴结彩超、胸腹部CT 等检查排除其他疾病所致继发性血小板减少，所有患者均根据出血评分系统进行出血评分［1］，收集初始治疗时血小板计数、骨髓巨核细胞总数、产板巨核细胞数、产巨比。选取同期住院脾功能亢进症患者20 例，其中男10 例，女10 例，年龄43 ～ 83 岁，平均（61.8 ± 10.05）岁。选取同期入院经骨髓细胞学检查确诊为MDS 患者16 例，其中男7 例，女9 例，年龄15～90 岁，平均（53.87 ± 21.86）岁。所有病例的诊断均依据2014年中华医学会血液学分会制定的《骨髓增生异常综合征诊断与治疗中国专家共识》确诊［4］。研究对象基本资料见表1。

表1 研究对象基本资料Tab.1 Basic information of research object ±s

组别ITP 组MDS 组脾功能亢进组例数50 16 20性别（例）男20 7 10女30 9 10年龄（岁）43.32±16.28 53.87±21.86 61.80±10.05 PLT 基数（×109/L）24.08±21.74 23.13±13.96 32.25±14.46

1.2 样本采集及处理所有患者在第一次入院时均进行血常规、骨髓细胞学及免疫球蛋白、淋巴细胞亚群检测，同时计数血小板水平、骨髓巨核细胞总数、产板巨核细胞数、产巨比（产板巨核细胞/巨核细胞总数），分别留取骨髓液2 管，每管1 mL，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，利用红细胞裂解液裂解成熟红细胞，运用流式细胞仪进行c⁃mpl检测，实验管加入鼠抗人APC⁃TPOR（CD110）、Per⁃CP⁃CD34、FITC⁃CD41、PE⁃CD61单克隆抗体各20 μL；阴性对照管中分别加入APC⁃鼠IgG1、PerCP⁃鼠IgG2、FITC⁃鼠IgG1、PE⁃鼠IgG2 各20 μL，均孵育30 min 后加入溶血素，避光溶血8 min，离心弃上清后用PBS 洗涤2 次，应用流式细胞仪（BD FACS Calibar，美国BD 公司）检测，每管记录细胞数均大于1 × 109/L。另一管进行离心分离出上清，液氮罐中保存，以留作TPO 浓度检测，采用双抗体夹心酶联免疫法（TPO ABC⁃ELISA 法检测试剂盒，为Merck 公司产品，Bio⁃Tek ELx⁃800 酶标仪），以抗人TPO 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的TPO 与单抗结合，加入生物素化的抗人TPO，形成免疫复合物连接至酶标板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色后加终止液硫酸颜色变深，在492 nm 处测OD值，TPO 浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中TPO 浓度。

1.3 治疗方案及疗效判定标准遵照ITP 诊治指南，所有首次入院ITP 患者均进入ITP 治疗路径，根据PLT 水平选择治疗方案，如PLTT ≥30×109/L选择临床观察治疗，如PLT < 30 × 109/L 则选用一线治疗方案，根据血小板水平、出血评分及患者经济条件，决定是否联合促血小板生成药物（IL⁃11针、特比奥针）或丙种球蛋白针。在本次研究中共有12 例患者仅用糖皮质激素［地塞米松针按照泼尼松1.0 mg/（kg·d）等效剂量静脉滴注］，11 例患者在地塞米松针治疗基础上加用了特比奥针或（和）IL⁃11 针，另有7 例患者三者联合治疗（糖皮质激素+促血小板生成药物+丙种球蛋白针）。定期检测血小板，疗效评判标准遵照成人原发性免疫性血小板减少症中国专家共识：（1）完全反应（CR）：治疗后PLT ≥100×109/L 且没有出血。（2）有效（R）：治疗后PLT≥30×109/L 并且至少比基础血小板计数增加两倍，且没有出血。（3）无效（NR）：治疗后PLT< 30 × 109/L 或者血小板计数增加不到基础值的两倍或者有出血。（4）复发：获得CR 或R 后，血小板计数再次<30×109/L 或有出血。定义CR 或R 时，应至少检测2 次，期间至少间隔7 d［1］。初期反应时间是指从开始用药到血小板恢复到≥30 ×109/L 或至少比基础血小板计数增加两倍，且没有出血情况的检测时间。

1.4 随访所有ITP 患者均在出院后进行门诊及电话随访，总随访时间1年。其治疗及观察疗程在3 ～ 12 个月之内。根据随访结果提供的血小板计数和临床出血情况评估患者疾病转归，并根据患者随访缓解情况进行分组，将病例分为治疗有效组（CR+R）共18 例，治疗无效/复发组（NR）共12例，其中1 联治疗方案有效7 例，无效5 例；2 联方案有效7 例，无效4 例；3 联方案有效4 例，无效3 例。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件进行分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，相关分析定量资料采用Pearson 相关分析，等级资料采用Spearman 相关分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TPO 浓度及其受体c⁃mpl 表达水平测定ITP 组总巨核细胞、产板巨核细胞均较MDS 组和脾功能亢进症组要高，但产巨比更低，差异均有统计学意义（P< 0.05），而TPO 和c⁃mpl 表达水平却比其他两组低，差异也均有统计学意义（P< 0.05）。见表2。

表2 三组间各观察指标统计Tab.2 The observation index statistics among the three groups ±s

注：&ITP 组与脾功能亢进症组比较，P<0.05；*ITP 组与MDS 组比较，P<0.05；#MDS 组与脾功能亢进症组比较，P<0.05

组别ITP MDS脾功能亢进& t 值P 值* t 值P 值# t 值P 值年龄（岁）43.32±16.28&53.87±21.86 61.80±10.05&-4.718<0.001-1.78 0.09 1.445 0.158 PLT 基数（×109/L）24.08±21.74 23.13±13.96 32.25±14.46-1.546 0.127 0.165 0.870 1.918 0.064总巨核细胞(个）405.64±131.83&*117.88±55.16*#202.15±92.91.239<0.001 8.462<0.001 3.38 0.002产板巨核细胞（个）122.98±43.24*52.18±24.06*#100.2±51.98#1.734 0.093 6.225<0.001 3.407 0.002产巨比（%）0.31±0.06*&0.45±0.08 0.49±0.12&-8.08<0.001-6.055<0.001 1.287 0.207 TPO 浓度（ng/mL）175.93±25.59*&221.89±43.56*#197.76±24.08&#-3.365 0.002-5.201<0.001-2.111 0.042 c⁃mpl 表达（%）1.07±0.29*&1.49±0.38*1.37±0.41&-3.34 0.001⁃4.525<0.001-0.925 0.362

2.2 不同血小板水平的ITP 患者TPO 及c⁃mpl 表达 PLT < 30 × 109/L ITP 患者TPO、c⁃mpl 表达水平高于PLT ≥30 × 109/L ITP 患者组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 不同血小板水平的ITP 患者TPO 及c⁃mpl 表达情况Tab.3 The expression of TPO and c⁃mpl in ITP patients with different platelet levels ±s

注：*两组比较差异有统计学意义，P<0.05

组别PLT<30×109/L PLT ≥30×109/L t 值P 值例数30 20性别（男/女）12/18 8/12年龄（岁）43.86±17.35 42.5±14.91 0.297 0.768巨核总（个）408.5±129.59 401.35±138.4 0.184 0.855产板巨（个）119.63±44.41 128.0±42.04-0.674 0.504产巨比0.29±0.06 0.32±0.06-1.949 0.058 TPO（ng/mL）182.65±20.71*165.84±29.26 2.224 0.033 c⁃mpl（%）1.17±0.24*0.92±0.32 2.973 0.005

2.3 不同治疗反应组相关因素分析 PLT<30×109/L ITP 患者中治疗有效组治疗反应时间比无效组短，产巨比比无效组低，出血评分比无效组高，差异均有统计学意义（P< 0.05），见表4。相关性分析结果显示，出血评分与疗效成正相关，反应时间产巨比与疗效成负相关（P<0.05），见表5。

表4 不同治疗反应组相关因素分析Tab.4 Analysis of related factors in different treatment response groups±s

注：*两组比较差异有统计学意义，P<0.05

组别有效组无效组t 值P 值例数18 12出血评分2.91±1.75*1.98±1.51 1.885 0.038病程（d）2.12±2.08 2.67±2.19-0.535 0.597 PLT 基数（×109/L）7.44±6.11 8.58±6.13-0.499 0.622反应时间6.01±2.35*8.18±3.75-2.621 0.001巨核总（个）415.33±132.83 398.25±129.67 0.35 0.729产板巨（个）118.55±44.58 126.25±46.07-0.159 0.875产巨比0.28±0.04*0.33±0.92-1.159 0.007 TPO（ng/mL）182.99±17.09 182.14±26.06 0.099 0.933 c⁃mpl（%）1.13±0.15 1.23±0.34-1.134 0.266

表5 疗效影响因素相关性分析Tab.5 Correlation analysis of influencing factors of curative effect

3 讨论

本研究发现，ITP 组与脾功能亢进症组在发病年龄上存在差异，ITP 组相对年轻，而脾功能亢进症患者发病年龄相对高，这与脾功能亢进症多继发于肝硬化、门脉高压症等疾病，并且多呈一个相对缓慢的发展过程、逐渐出现失代偿有关，而与MDS 组相比二者无差异。在发病时血小板计数水平上三者之间差异均无统计学意义。在骨髓产生巨核细胞功能上看，三者之间差异均有统计学意义。其中ITP 患者巨核细胞总数相对更高，脾功能亢进症患者居中，而MDS 患者巨核细胞总数相对最少，提示ITP 患者存在骨髓巨核系代偿性增生，但产板巨核细胞相对较低，与MDS 组相比差异有统计学意义。ITP 组产巨比（产板巨核细胞/总巨核细胞）与脾功能亢进症组和MDS 组比较差异均有统计学意义，提示ITP 患者存在巨核系发育成熟障碍，产巨比也可以作为ITP 与其他血小板减少性疾病的鉴别诊断要点之一，但具体产巨比临界值需要进一步探讨。

在TPO 浓度上，三者之间比较差异均有统计学意义，MDS 患者TPO 浓度水平最高，脾功能亢进症者次之；而在其受体表达水平上，MDS 受体表达水平更高，ITP 表达水平最低，两者之间比较差异有统计学意义，脾功能亢进症组表达水平居中，与ITP 组比较差异有统计学意义，但与MDS 组相比差异无统计学意义。

在PLT<30×109/L 组和PLT ≥30×109/L 组二者之间发病年龄上差异无统计学意义，在出血评分方面差异有统计学意义，且发病时间上前者发病时间急，病程短，多1 天至数天，且出血更严重，多伴有轻微或严重出血，而PLT ≥30×109/L 组中，血小板水平相对更高，而在PLT<30×109/L 组中，血小板多呈比较低的状态，出血评分与血小板水平呈负相关关系（r=-0.778，P<0.05）。但二者在巨核细胞总数、产板巨核细胞及产巨比三方面来比较差异均无统计学意义。在TPO 表达水平上，PLT < 30 × 109/L 组中TPO 浓度比PLT ≥30 × 109/L组TPO 浓度更高，且与血小板水平呈负相关关系（r=-0.369，P<0.05），但相关性不强。同样，在c⁃mpl 表达水平上，PLT < 30 × 109/L 组中c⁃mpl 表达更高，而PLT ≥30×109/L 组中表达相对更低，与血小板水平呈负相关关系（r=-0.474，P< 0.05），但与TPO 水平呈正相关关系（r= 0.707，P< 0.05）。在相关性分析中发现出血评分和发病时间是影响治疗方案选择的主要因素，但治疗方案对疗效无直接影响。通过对ITP 不同治疗反应患者对比研究发现，早期反应时间、出血评分、产巨比在治疗有效组和无效组之间差异有统计学意义，提示这些指标可能对预后评估有较大影响，反应时间越短、产巨比越低、出血评分越高达到缓解几率越大，也许对预后有着一定预测意义。对上述指标进行相关性分析发现出血评分与预后呈正相关关系（r= 0.401），反应时间与预后呈负相关关系（r=-0.534），产巨比与预后呈负相关关系（r=-0.373），但相关性不强，尚需积累更多的实验数据来证实。

ITP 是血液科非常常见的一种疾病，可表现为出血、疲劳乏力，血常规中主要表现为单一血小板减少、白细胞及红细胞水平正常，部分出血严重者可伴有贫血，尽管没有证据表明出血严重程度与患者血小板水平之间的关联程度，但一般认为PLT ≥50×109/L 时发生出血风险相对较少，而PLT<30×109/L时极易发生出血［5］。到目前为止，ITP 尚没有确诊实验依据，依然是排他性诊断，那么能否从常规实验检查中寻求一些对ITP 的诊断有确诊意义的分子标志物显得非常重要。

血小板生长发育过程中需要许多细胞因子参与作用，随着人们认识的深入，发现其中最为重要的有：血小板生成素（thrombopoietin，TPO），它是巨核细胞增殖、成熟和血小板产生过程中的主要调控因子，作用非常广泛，涉及到造血细胞增殖、分化和成熟的全过程，通过与其受体结合而发挥上述调控功能［6-7］。TPO 基因定位于染色体3q27，全长6.2 kb，由7个外显子和6个内含子组成，肝脏、肾脏、肌肉及骨髓中都含有丰富的TPO mRNA，其表达水平受血小板数量反馈调节。血小板生成素受体c⁃MPL 基因定位于1p34，全长9 kb，由12 个外显子和11 个内含子组成，在造血干细胞、巨核前体细胞、血小板表面都有表达，二者通过多种信号传导途径发挥作用。通过与TPO 结合，促进巨核细胞和造血干/祖细胞增殖分化，发育至成熟血小板，另一方面又能通过血小板上的TPO 结合位点，清除并使TPO 代谢，从而维持血小板造血平衡［8-9］。本研究发现ITP 患者多伴有内源性TPO 不足，同时c⁃mpl 表达水平也相对不足。而脾功能亢进症及MDS 患者骨髓TPO 和c⁃mpl 表达水平均比ITP 组高，在三者中MDS 表达水平最高，SEIKI 等［10］发现MDS 患者TPO 水平升高，并且在不同的组别中显示出差异，高TPO 水平多提示MDS 低危、预后良好。MDS 病例数相对较少，未对MDS 患者进行危险度分层，只是与ITP 患者进行了比较。从这点上来看，TPO 和C⁃MPL 水平可以作为ITP 与其他血小板减少相关性疾病的鉴别诊断依据，但需要进一步扩大样本量以找出作为鉴别意义的界定值范围。这也为ITP 患者进行TPO 及其受体激动剂治疗提供了实验依据。但由于进行治疗的患者数有限，尚未能明确ITP 患者骨髓TPO 及c⁃mpl 水平对疗效是否有影响，尚需要进一步加大样本量。

既往的研究中认为TPO 可以使其受体c⁃mpl mRNA 表达下调（down⁃regulation），这种作用具有剂量依赖性［11］，外加的rhTPO 越高，c⁃mpl mRNA 表达越低，TPO 降低，情况则相反，它反映了细胞因子调节的多样性，即TPO 不存在转录水平的负反馈调节，但能够通过对受体c⁃mpl mRNA 的下调来实现对自身功能的调节。另一方面，血小板和巨核细胞的数量可通过反馈机制调控TPO 的基因表达，从而维持机体巨核系发育、血小板生成的动态平衡［12］。但本研究发现，ITP 患者的骨髓TPO 和c⁃mpl 表达水平并没有因为血小板水平低下而反馈性升高，也提示ITP 患者的发生可能与体内TPO及c⁃mpl 水平相对不足有关。但将ITP 患者组按血小板水平来进一步分为PLT < 30 × 109/L 和PLT ≥30 × 109/L 组发现，二者在TPO 水平、c⁃mpl 表达水平上还是存在差异的，PLT < 30 × 109/L 组中TPO和c⁃mpl 表达水平要高，因此表明ITP 患者体内依然存在一定的反馈调节作用，但因为本研究涉及病例数有限，反馈调节作用并不明显，后期可以考虑进一步加大样本量、优化分组检测。

在绝大多数ITP 患者中骨髓绝大多数均增生活跃，巨核系统增生活跃，巨核细胞总数也明显增加［13］，近年来有研究表明在ITP 的发病过程中巨核系的凋亡发挥了很大作用，DENG 等［12］通过检测凋亡标志物发现ITP 患者中促凋亡分子（如Bak 和Bax）增强，而抗凋亡分子（如Bcl⁃xL）的表达明显减弱，提示血小板凋亡增强；VON 等［14］证实程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）途径在巨核细胞谱系的发育成熟中起着独特的作用。由于遗传或环境因素的干扰，使得这些严格调控的途径出现紊乱、不平衡，最终导致血小板生成减少。因此认为PCD 失调与ITP 中的外周血血小板破坏，髓内细胞凋亡和无效的血小板生成有关。在本研究中发现ITP 患者骨髓巨核细胞总数较脾功能亢进者及MDS 患者均要高，但产板巨核细胞却比较低，与前述观点一致。总之巨核系的发育成熟障碍在ITP 的发生发展中起着至关重要的作用［15］。通过抑制巨核系凋亡，诱导巨核细胞发育分化，也许是未来ITP 治疗研究方向。

目前ITP 的治疗手段非常多，其中一线治疗主要包括糖皮质激素及静脉注射用丙种球蛋白针，临床比较常用的二线治疗如IL⁃11、促血小板生成素（TPO 制剂），但每种治疗手段都有其优劣性，疗效并不确切［16］，约有60% ～ 70%成人患者需要选择其他二线治疗，包括脾脏切除、TPO 受体激动剂、其他免疫抑制剂等，对于不同的患者有明显的个体差异性［1］，仅对于糖皮质激素而言在用药剂量、用药疗程以及药物种类的选择等方面，在临床仍存在诸多争议［17］，如何避免严重不良反应，获得最好治疗效果、性价比相对更高的治疗手段，目前仍不清楚。在精准治疗时代如何对ITP 患者选择更为精准的手段来治疗，是目前非常重要的研究内容。尽管部分患者在发作一次后即能达到立即缓解，也有70%患者可以在诊断很长一段时间后出现自然缓解或治疗后缓解，还有30%患者会出现复发［2］。在临床治疗过程中，治疗方案的选择多取决于起病的急缓、病程的长短、出血评分，但ITP 患者最终治疗效果与治疗方案选择并没有必然的联系，而鉴于治疗方案的潜在副作用、给患者带来的相应经济负担，实际上临床医生迫切需要一种行之有效的可以预测影响疗效的相关因素，从而在选择治疗方案时才能做到有的放矢。但在本研究中发现治疗有效组和治疗无效组在治疗前出血评分、治疗反应时间、产巨比三方面差异有统计学意义，与疗效之间有一定相关性，但相关性并不强，总巨核细胞、TPO 浓度及c⁃mpl 表达水平与疗效无明显相关性，同时考虑到本研究样本量少，需要加大样本量进一步明确。

总之，ITP 的发病机制目前尚未完全明了，无确诊实验依据，需排他性诊断，TPO 浓度、c⁃mpl 表达水平及产巨比降低均有助于ITP 的诊断，但需要进一步明确参考值范围。出血评分、治疗反应时间和产巨比对预后有一定的预测价值，但也需要进一步加大样本量检测其可靠性，也值得进一步深入研究。巨核系凋亡及血小板程序性死亡值得进一步探讨，抑制巨核系凋亡、诱导发育分化也许将成为未来ITP 治疗新选择。