基于PI3K/AKT信号传导通路探究骨痹合剂对膝关节骨关节炎小鼠细胞凋亡和相关蛋白水平表达的影响

廖建青 吕静 张英杰 谢邦 马富文 王琦

1云南中医药大学（昆明650500）；2云南省中医医院（昆明650021）

膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是常见于中老年人的一种慢性骨关节疾患，与年龄、性别、肥胖、居住环境潮湿阴暗、站姿工作习惯、重体力劳动职业、膝关节外伤史、基因等因素相关［1⁃3］。其主要临床表现为膝关节疼痛、肿胀、畸形、失去活动能力，疼痛可在活动时、上下楼梯时加重，关节局部有压痛［4］。相关研究显示，我国人口老龄化比例不断上升，40 岁以上中老年人KOA 总患病率为17.0%，且随年龄增长患病率呈不断上升的趋势［5⁃6］。晚期膝骨关节炎主要以手术治疗为主［7］，而早中期多数患者更愿意选择中医药保守治疗。因此，在中医药中寻找安全有效防治KOA 的药物，以提高患者的生活质量、延长寿命成为现代中医药研究的一大热点。研究表明PI3K/AKT 信号传导通路在KOA 的发病机制中尤为重要，对软骨细胞增殖、凋亡具有重要的调控作用［8⁃9］，本课题基于PI3K/AKT 信号传导途径来探讨具有活血通络作用的骨痹合剂防治KOA 的分子机制，从现代分子生物学角度揭示KOA 的发生发展机制与中医学论治“活血通络，通则不痛”相关理论的内在关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级C57 小鼠60 只，体质量（19.6±0.6）g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物许可证号：SCXK（苏）2017⁃0001。小鼠置于IVC 动物实验房中，随机每笼5 只。正常饲养，常规饮食，室温20～24 ℃，相对湿度42%～53%，日照时间为每天10～12 h，空气流通。本研究通过云南中医药大学第一附属医院伦理委员会审查，伦理批件号：动物2016⁃001。

1.2 实验试剂 甲苯胺蓝染液（Aladdin T104232）；苏木素染液（珠海贝索BA4097）；Tunel试剂盒（南京凯基生物KGA704）；DAB 显色剂（DAKO K5007）；TEMED（Alladin T105496）；甘氨酸（Solarbio G8200）；蛋白酶抑制剂cocktail（Roche 4693116001）；HRP 抗小鼠抗体（Beyotime A0216）；HRP 抗兔抗体（Beyotime A0208）；HRP 抗山羊抗体（Beyotime A0181）。

1.3 实验仪器 组织脱水机PQT⁃A、组织包埋机PBM⁃A、组织摊片机PHY⁃Ⅲ（常州普瑞斯星医疗器械有限公司）；病理切片机RM2235（上海徕卡仪器有限公司）；显微镜（日本尼康，NIKON H550S）；湿法转膜仪170⁃3930 Bio⁃Rad。

1.4 实验药物 骨痹合剂（滇药制字（Z）04A01888）由云南中医药大学第一附属医院制剂室提供；氨糖美辛肠溶片（国药准字H20023171）购自上海华中药业有限公司。

1.5 实验方法

1.5.1 动物模型制备 取10 周龄SPF 级C57 雄性小鼠60 只，4%戊巴比妥钠腹腔麻醉，小鼠膝关节部位剃毛、备皮消毒，取髌旁内侧切口显露膝关节，切断前交叉韧带，止血，关节腔逐层闭合。术后3 d 每天予每只小鼠肌肉注射青霉素（8 万单位/kg）以预防感染。

1.5.2 动物分组、给药及取材切片 造模8 周后，60 只小鼠称重记录并随机分为骨痹合剂组、氨糖美辛组、生理盐水组3 组，每组20 只。自由进食饮水1 周后，骨痹合剂组小鼠予骨痹合剂13 mL/（kg·次）灌胃，氨糖美辛组小鼠予19.5 mg/（kg·次）灌胃，对照组予等体积生理盐水灌胃；每日上、下午各一次。灌胃8 周后小鼠4%戊巴比妥钠腹腔过麻处死，分离膝关节并保留其相连的胫骨和股骨，取下双膝关节，固定新鲜组织于4%多聚甲醛24 h 以上，将膝关节组织部位用手术刀修平整后，对应标签置于脱水盒中，再放入脱水机内依次梯度酒精予脱水、浸蜡、包埋处理。-20 ℃冻台冷却，蜡凝固后取出修整，切片，片厚4 μm。于摊片机40 ℃温水上将切片组织展平后用载玻片捞起，烤片，常温保存备用。

1.5.3 甲苯胺蓝染色 石蜡切片至水，置于60 ℃温箱用0.5%甲苯胺蓝染色40 min，95%乙醇镜下控制分色，将切片依次放入无水乙醇Ⅰ5 min ⁃无水乙醇Ⅱ5 min⁃二甲苯Ⅰ5 min ⁃二甲苯Ⅱ5 min 中脱水透明，取出稍晾干后中性树胶封片，显微镜下镜检，并作图像采集分析。

1.5.4 Tunel 法检测细胞凋亡 石蜡切片至水，滴加蛋白酶K 工作液覆盖组织，37 ℃温箱孵育30 min，置于PBS 中洗3 次，每次5 min。切片稍甩干滴加破膜工作液覆盖组织，重复上述操作。采用Tunel 试剂盒按照说明书操作进行细胞凋亡鉴定，细胞凋亡结果判定：切片中软骨细胞细胞核内棕黄色颗粒者为阳性细胞，凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.5.5 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测各组软骨细胞中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白的表达 取分离好的软骨组织约50 mg，研磨收集骨粉加入1 000 μL RIPA 裂解液，在冰上裂解30 min，离心，取上清转移至1.5 mL 离心管中，-20 ℃保存，测定蛋白含量。清洗玻璃板、灌胶、上样，电泳，终止电泳，转膜。膜晾干后，TBS 浸湿，再移至含有封闭液（5%脱脂奶粉TBST 溶液）的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。用含5% BSA 的TBST溶液按照1∶1 000 稀释于4 ℃孵育过夜。用TBST按照1∶5 000 稀释，室温下孵育2 h 后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗3 次，每次10 min；进行化学发光，于Tanon5200 化学发光成像仪下拍照，获取图片。

1.6 统计学方法 应用SPSS 17.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，两组比较采用t检验，多组之间两两比较采用q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲苯胺蓝对各组软骨细胞的染色情况 与生理盐水组比较，骨痹合剂组与氨糖美辛组软骨组织有明显改善，甲苯胺蓝染色较深，见图1。

图1 各组软骨细胞的甲苯胺蓝染色的不同表达情况Fig.1 Different expressions of toluidine blue staining in chondrocytes of each group

2.2 Tunel 法检测各组软骨细胞凋亡情况 与生理盐水组相比较，骨痹合剂组与氨糖美辛组软骨组织细胞凋亡明显减少（P<0.01），见表1、图2。

图2 Tunel 检测各组软骨细胞凋亡水平的表达Fig.2 Expression of apoptotic level of chondrocytes in each group detected by TUNEL

表1 各组200 倍视野下凋亡细胞数目Tab.1 The number of apoptotic cells in each group at 200 times field of vision ±s

表1 各组200 倍视野下凋亡细胞数目Tab.1 The number of apoptotic cells in each group at 200 times field of vision ±s

注：**表示P<0.01

组别凋亡细胞数目生理盐水组27.67±4.04骨痹合剂组11.00±4.36**氨糖美辛组11.67±3.06**

2.3 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测各组PI3K、AKT 和mTOR 蛋白的表达 与生理盐水组比较，骨痹合剂组小鼠关节软骨中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达下降（均P< 0.05）；氨糖美辛组小鼠关节软骨中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达均下降（P<0.01），见图3。

图3 蛋白质免疫印迹法检测各组软骨细胞内PI3K、AKT、mTOR 蛋白的表达Fig.3 Expression of PI3K/Akt /mTOR protein in chondrocytes of the each group detected by Western blotting

3 讨论

本研究主要通过切断前交叉韧带法以建立KOA 小鼠模型。膝关节炎的造模方法主要有关节内手术（Hulth 法、前交叉韧带切断法、半月板切除法、软骨缺损法、破坏关节稳定术、破坏关节血液循环术），非手术方法（关节制动、寒冷刺激、关节撞击）；关节腔内注射药物法（尿激酶型纤溶酶原激活物、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶等）［10］。通过甲苯胺蓝染色发现生理盐水组中软骨表面缺损，染色基本缺失，Tunel 法检测到软骨表面大量细胞凋亡，说明本次造模KOA 凋亡模型成功。在动物试验中公认的造模方式多样，但整个造模过程对实验动物造成了极大痛苦，如何能减轻实验动物的痛苦而取得需要的实验模型，是未来实验研究的方向所在，如何通过正常的软骨细胞运用药物诱导或物理作用的方式取得成功实验模型，本课题将在进一步细胞实验中进行研究。

膝关节骨关节炎主要以关节软骨退变为病理特征，虽然正常软骨细胞也存在凋亡现象，但应激状态下的软骨细胞过度凋亡会导致软骨基质变化，以致软骨发生退行性改变［11］。细胞凋亡是受基因调控的一种细胞程序性死亡的过程，参与生理和病理过程，而PI3K/AKT/mTOR 信号通路为调控软骨细胞增殖生长、凋亡及软骨细胞外基质重塑方面的一条重要通路［12］。PI3K 是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，由调节亚基p85 和催化亚基p110 构成［13］，AKT 又称PKB（protein kinase B），是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，能调控各种不同细胞的生长代谢、转录以及蛋白质合成。当PI3K 接收细胞膜上的各种传入信号后直接或间接激活下游部位的AKT，后者磷酸化作用于P53、NF⁃κB 及Caspase⁃9 而发挥特异性的生物学作用［14⁃15］。XU等［16］研究发现抑制PI3K/AKT/NF⁃κB 信号通路的激活能抑制软骨细胞的凋亡，减轻骨性关节炎炎症反应。段志远等［17］研究发现蛇床子素可显著降低PI3K、AKT 及NF⁃κB 蛋白的表达，缓解KOA 大鼠关节软骨退变。NF⁃κB 是PI3K/AKT 下游靶蛋白之一，是参与炎症、免疫反应和细胞凋亡的重要信号通路［18］。XUE 等［19］研究发现抑制PI3K/AKT 通路能诱导细胞自噬，减轻炎症反应。细胞自噬参与了关节软骨退化的过程，而mTOR 是自噬的主要负性调节因子，mTOR 通路被抑制可诱导自噬，从而起到保护软骨细胞的作用［20⁃21］。mTOR 也具有调控KOA 关节软骨退变的作用［22］。因此，mTOR 是细胞凋亡及自噬信号传导通路的交汇点，对细胞的凋亡和自噬都具有关键性的调控作用［23⁃24］。

我院骨伤科在多年来运用中医药治疗膝关节骨关节炎的学术思想及临床经验的基础上，采用具有活血通络作用的骨痹合剂进行治疗，其主要成分包括当归、丹参、红花、桂枝、桑寄生、地龙、杜仲、枸杞、苍术、细辛等十多味药物，全方以活血通络为主，又兼祛风除湿、补益肝肾。前期临床试验和基础研究表明以具有活血通络作用的骨痹合剂治疗KOA 作用机理是通过改善软骨退变过程中的软骨机制代谢、抑制氧自由基损伤、软骨细胞凋亡及调节细胞因子等多种生物学效应，从多途径、多靶点延缓软骨退变，控制KOA 进展［25］，但其具体作用机制尚未明确。本次课题研究结果显示：甲苯胺蓝染色中，生理盐水组中软骨表面可见缺损，软骨表面大量细胞凋亡；而骨痹合剂组与氨糖美辛组染色较深，软骨组织有明显改善，细胞凋亡明显减少（P<0.01），说明骨痹合剂能减少KOA 软骨细胞凋亡；相比生理盐水组，骨痹合剂组小鼠关节软骨中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达均下降（均P< 0.05）；氨糖美辛组小鼠关节软骨中PI3K、AKT和mTOR 蛋白表达均下降（P< 0.01），说明具有活血通络作用的骨痹合剂能下调PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达，抑制PI3K/AKT 信号通路，从而减少软骨细胞凋亡，缓解KOA 小鼠的炎症反应。

综上所述，具有活血通络作用的骨痹合剂对KOA 小鼠软骨细胞具有明显的改善作用，其作用机制是下调PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达，抑制PI3K/AKT 信号通路，从而减少软骨细胞凋亡，以缓解膝骨性关节炎进一步发展。