胆囊癌组织星形胶质细胞上调基因1异常表达与临床病理及预后的关系

崔大鹏 张迎春 宋文丽 张鹏娟 张星月 刘振显 连晶晶 刘博

河北北方学院附属第一医院1肝胆外科，2普通外科，3护理部，4检验科，5病理科（河北张家口075000）

胆囊癌发病率居消化系统肿瘤的第6 位，占胆道肿瘤的80%～95%，多数患者起病隐匿，早期多缺乏典型表现，使得早期诊断较难，确诊时已进入晚期或出现转移［1］。目前胆囊癌疾病生物学机制研究尚不充分，缺少特异性预后标志物［2-3］。癌胚抗原等消化道肿瘤常用肿瘤标记物的特异性较低，对病情和预后的评估价值有限［4］。星形胶质细胞上调基因1（astrocyte elevated gene⁃1，AEG⁃1）是近年发现的与肿瘤侵袭和转移相关的癌基因，已被发现在乳腺癌、食管癌等多种恶性肿瘤中表达［5-6］，但有关其与胆囊癌患者临床病理及预后关系的研究仍较为缺乏。本研究以128 例胆囊癌患者为例，探讨胆囊癌组织AEG⁃1 表达与临床病理及预后的关系，以期填补研究空白，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月至2018年6月本院收治的128例胆囊癌患者，其中男49例、女79例；年龄31～82 岁，平均（53.61 ± 7.11）岁；临床症状：右季肋区疼痛77 例、纳差45 例、腹胀16 例。

纳入标准：（1）采取手术治疗，经术后病理确诊为胆囊癌；（2）术前无相关治疗史；（3）签署知情同意书。

排除标准：（1）有癌症家族史者；（2）伴其他系统恶性肿瘤者；（3）非原发性胆囊癌患者；（4）随访资料不完善或失访者。

1.2 方法

1.2.1 癌组织AEG⁃1表达的检测 128例患者均根据TNM分期接受相应治疗，其中42例采取根治术，包括单纯胆囊切除术、根治性切除等；45 例接受姑息性手术，包括单纯胆囊切除或胃肠吻合；41 例患者接受剖腹活检术。术中均保留癌组织标本进行癌组织AEG⁃1 检测：组织石蜡包埋、切片及脱蜡，修复抗原后牛血清白蛋白封闭。37 ℃下温育一抗90 min（兔抗人AEG⁃1，北京中杉金桥），磷酸缓冲盐溶液冲洗。二抗孵育20 min，使用二氨基联苯胺试剂盒显色。AEG⁃1 主要在细胞质中表达，阳性细胞呈黄色或棕色，显微镜下取不同视野确定AEG⁃1 阳性染色细胞占比和染色程度。（1）AEG⁃1阳性染色比例：阳性细胞百分比＜5%，0 分；5%～20%，1分；26%～50%，2分；＞50%，3分。（2）AEG⁃1阳性染色强度：无染色，0 分；淡黄色，1 分；棕黄色，2 分；棕黄色，3 分。AEG⁃1 染色评分=染色比例评分×染色强度评分，≤1 分，阴性；1～3 分，弱阳性；＞3 分，阳性。根据癌组织AEG⁃1 表达分为AEG⁃1 阳性（92 例）和AEG⁃1 阴性（36 例）。

1.2.2 随访结果 术后随访2年，记录生存时间。随访结束时存活患者生存时间为随访时间，死亡患者生存时间为随访开始至死亡的时间。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 进行统计学分析，计数资料用例（%）表示，比较采取χ2检验，以P< 0.05 为差异有统计学意义。采用多因素COX回归分析确定胆囊癌患者生存影响因素，绘制Kaplan⁃Meier 生存曲线。

2 结果

2.1 胆囊癌组织AEG⁃1 表达情况及组织病理学切片观察 128 例胆囊癌患者中，癌组织AEG⁃1 阳性表达率71.87%（92/128）。AEG⁃1 主要表达于细胞质，呈黄色或棕色。AEG⁃1 在组织中典型阳性表达见图1A），典型阴性表达见图1B。

图1 AEG⁃1胆囊癌组织中阳性表达（A）和阴性表达（B）Fig.1 Positive expression（A）and negative expression（B）of AEG⁃1 in gallbladder carcinoma tissue

2.2 胆囊癌组织AEG⁃1表达与临床病理的关系不同肿瘤最大径、病理分型、分化程度、TNM 分期、胆总管浸润、肝脏侵袭和淋巴结转移患者的AEG⁃1 阳性例数的占比差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 不同临床病理特征的胆囊癌患者的AEG⁃1 表达比较Tab.1 Comparison of AEG⁃1 expression in gallbladder cancer patients with different clinicopathological characteristics例

2.3 胆囊癌的生存影响因素 以患者随访2年的生存情况（存活=1、死亡=0）为因变量进行多因素Cox 回归分析，结果显示手术方式、肿瘤最大径、分化程度、TNM 分期、胆总管浸润、淋巴结转移、AEG⁃1表达是胆囊癌患者生存的影响因素（P<0.05）。见表2。

表2 胆囊癌患者生存的多因素Cox 回归分析Tab.2 Multivariate Cox regression analysis of the survival of patients with gallbladder cancer

2.4 不同AEG⁃1 表达患者的生存分析 AEG⁃1 阳性患者的生存率3.26%（3/92），阴性患者36.11%（13/36），Kaplan⁃Meier 生存曲线经Log⁃rank 检验差异有统计学意义（P=0.009）。见图2。

图2 AEG⁃1 阳性和AEG⁃1 阴性患者的Kaplan⁃Meier 生存曲线Fig.2 Kaplan⁃Meier survival curve of AEG⁃1 positive and AEG⁃1 negative patients

3 讨论

3.1 胆囊癌患者AEG⁃1 表达与临床病理特征的关系 既往实体瘤研究中发现AEG⁃1 在非小细胞肺癌患者中异常高表达，且与肿瘤分期、转移等有密切关系［7］。同时体外研究显示子宫颈癌患者AEG⁃1 过表达对宫颈癌的发生、发展起重要作用［8］。本研究发现，128 例胆囊癌患者中AEG⁃1 阳性率高达71.87%，高于杨安等［9］报道的胃癌患者中AEG⁃1 阳性率50.65%和毛英等［10］报道的葡萄膜黑色素瘤患者中AEG⁃1 阳性率的58%。国外研究认为［11］，肿瘤的发生和进展均离不开肿瘤血管生成，而AEG⁃1 高表达可增加微血管密度，促进血管生成，增加肿瘤体积。胆囊癌的病理分型以腺癌为主，腺鳞癌、鳞癌较少见，通常只占10%～20%。有研究发现［12］，腺鳞癌、鳞癌常表现为肿瘤体积相对较大、肿瘤分期晚，预后相对较差，而AEG⁃1 阳性会强化肿瘤的增殖和侵袭能力，这是造成本研究中鳞癌和腺鳞癌患者的AEG⁃1 阳性率相对腺癌患者更高（87.50%vs.66.67%）的主要原因。常亮研究表明［13］，下调乳腺癌细胞AEG⁃1 表达后肿瘤细胞凋亡加快，提示AEG⁃1 可影响细胞周期阻滞，通过调控肿瘤细胞凋亡对患者临床分期产生影响。AEG⁃1 阳性可诱导细胞生长，阻滞细胞凋亡和细胞分化。因此AEG⁃1 阳性的低分化占比更高。动物实验发现［14］，AEG⁃1 可通过增加低氧诱导因子⁃1α 表达的途径间接提高血管内皮生长因子水平，从而促进肿瘤进展，增加TNM 分期。此外，AEG⁃1 过表达会促进乳腺癌细胞的上皮间充质细胞转化，使肿瘤的侵袭能力加强，因此更易发生胆总管浸润、肝脏侵袭和淋巴结转移［15］。

3.2 AEG⁃1与胆囊癌患者预后 国外研究发现［16］，AEG⁃1 是核转录因子κB 的正调控蛋白，可增强核转录因子κB 启动子活性，促使其与DNA 的结合能力，进而调控肿瘤细胞生长、侵袭及血管新生。AEG⁃1 可激活磷酯酰肌醇⁃3 激酶/蛋白激酶B 信号通路及其下游基因，强化肿瘤的抗凋亡能力和侵袭能力［17］。本研究结果证实AEG⁃1 高表达参与肿瘤发生和进展，可通过抑制肿瘤细胞凋亡、强化肿瘤细胞侵袭和转移等多种途径影响生存情况［18］。研究发现［19］，AEG⁃1 高表达会上调双氢嘧啶脱氢酶等耐药基因，影响肿瘤耐药。国外实验发现［20］，小干扰RNA 沉默AEG⁃1 后，肝癌细胞对5⁃FU 敏感性提高。也有研究表明［21］，AEG⁃1 可通过对多药耐药基因表达的调控介导对阿霉素的耐药。本研究COX 多因素回归结果显示，在校正混杂因素后，AEG⁃1 阳性表达与不良预后相关，提示靶向干预AEG⁃1 蛋白或其相关信号通路，有可能改善胆囊癌患者的预后，AEG⁃1 也可作为胆囊癌的治疗潜在靶点。最近在消化道肿瘤体外研究中发现，AEG⁃1 与肿瘤增生和转移存在密切联系。在胰腺细胞系中采用RNA 干扰AEG⁃1 基因表达后，可显著抑制胰腺癌细胞的侵袭转移能力［22］。而在胃癌组织中，AEG⁃1 可以通过eIF4E/cyclin D1 信号通路促使胃癌细胞增殖［23］。上述体外研究初步指明AEG⁃1 在消化道肿瘤中的潜在价值，而本文数据显示胆囊癌患者中，AEG⁃1 阳性表达是患者预后的危险因素。本研究随访时间较短，仅观察了患者随访2年的生存情况，未能统计患者的远期生存，为研究不足之处，有待后续补充。

综上所述，胆囊癌组织AEG⁃1 表达与患者肿瘤最大径、病理分型、分化程度、TNM 分期、周围组织侵犯等临床病理特征有较大关联，且AEG⁃1 阳性是预后影响因素。