慢性乙型肝炎中医证型与HLA-A24、CW1基因及ALT、AST相关性研究

杨小蓉，蔡祥胜，卢汉威，黄演婷，陈小明

1 广东药科大学附属第一医院 广东广州 510080

2 中国科学院大学深圳医院（光明）医学实验中心 广东深圳 518000

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种含有部分DNA双链的嗜肝包膜病毒，其大包膜蛋白的N-末端与肝细胞基地外侧区的受体-牛黄胆酸钠多肽（NTCP）相互作用实行细胞粘附和病毒进入[1]，宿主被感染后其免疫系统与HBV经过一系列复杂的免疫反应过程后，一般会出现三种情况：①HBV病毒DNA整合到宿主细胞中，引发长期慢性持续性炎症细胞浸润可发展为慢性乙型肝炎、肝硬化，甚至肝癌；②宿主直接清除病毒；③宿主与病毒长期平衡状态，即携带者。亦即中医诊疗中的“邪正相争”。宿主基因HLA-A24及CW1与慢性乙型肝炎不同中医证型的相关研究尚未见报道，本研究拟通过检测宿主基因HLA-A24，CW1、乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）及生化指标丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST）的变化，并分析各因素与慢性乙型肝炎中医证型的相关性，为临床诊疗提供一个方向。

资料与方法

1 入组标准

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准 参照2005年第6次全国传染病与寄生虫病会议修订的《病毒性肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎诊断标准[2]。

1.1.2 中医辨证分型诊断标准 参照1991年中国中医药学会肝病专业委员会制定的辨证标准（试行）中慢性乙型肝炎的中医辨证标准[3]，分为肝胆湿热证，肝郁脾虚证，肝肾阴虚证，瘀血阻络证及脾肾阳虚证5个证型。

1.2 纳入标准 ①HBsAg阳性时间持续超过6个月，丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高达正常值2倍以上；②年龄19～77岁，性别不限；③签署知情同意书。

1.3 排除标准 ①甲、丙、丁、戊型肝炎的重叠感染；②EB（EPstein-Barr）病毒、巨细胞病毒（CMV）感染；③药物性肝损伤、中毒性肝损伤、自身免疫性肝病、酒精性肝病及脂肪肝，无干扰素治疗史；④有心脑血管、肺、肾、内分泌及造血系统严重原发性疾病；⑤相关指标不完整者。

2 一般资料

该研究经医院伦理委员会批准，98例病例为2011年4月-2012年4月在广东药科大学附属第一医院感染科就诊的慢性乙型肝炎患者，其中男88例，女10例，年龄27～78岁，平均年龄（50.06±11.0）岁；肝胆湿热证型24例（24%），肝郁脾虚证型15例（15%），肝肾阴虚证型18例（18%），瘀血阻络证型31例（31%），脾肾阳虚证型10例（10%）。40例健康对照来自于接种过乙肝疫苗并产生表面抗体的健康人群，男16例，女24例，年龄19～81岁，平均（44.3±21.2）岁，各组在性别及年龄上的差异均无统计学意义（P>0.05）。

3 观察指标及检测方法

3.1 标本收集 抽取患者静脉血4ml，用于检测HBV DNA及ALT及AST，再抽取EDTA-Na抗凝全血2ml，采用酚-氯仿-异戊醇方法提取白细胞中DNA，为后续检测基因HLA-A24，CW1备用。

3.2 HBV DNA定量检测 分离血清后按照使用说明书，实时荧光定量-PCR法检测血清中HBV DNA的含量，仪器为DA-7600，试剂购买于中山大学达安基因有限公司，检测下限为500U/ml。

3.3 肝功能指标ALT及门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测 标本按照标准操作采集空腹血清或肝素钠抗凝血浆，运用底物法检测各证型病例及对照组血清中的ALT及AST，仪器为全自动生化分析仪日历-7180，试剂购买于四川迈克生物股份有限公司。

3.4 HLA-A24，HLA-CW1基因定量检测 引物合成及测序均在上海生物工程公司完成，电泳仪为北京六一仪器厂，荧光定量PCR仪应用美国ABI公司的ABI-7500，pMD载体为日本TAKARA公司产品，在HLA-A24第一外显子序列（Genbank登录号：AH004915.2）CDS区域设计上下游两个引物及Taqman 探 针：5’-TTCTCA CACCGTCCAGAGGAT-3’，5’-GAGCGCAGGTCCTCTTTCAG-3’，FAM-5’-TCGGACTGGCGCTTCCTCCG-3’-TAMRA；HLA-CW1基因（GenBank登录号：AH0117 49.2）CDS区设计上下游两个引物及Taqman探针：5’-GCTCCCACTCCATGAAGTATTTCT-3’，5’-CTGTCGAACCGCACGAACT-3’；通过普通PCR扩增出184bp和171bp的片段后，连接，转化，测序，酶切鉴定后，运用载体pMD20/HLA-A24/CW1，按 照 104～ 107copies/ml稀释倍数稀释，实时荧光定量PCR检测各稀释倍数质粒（反应条件：95℃变性 30s，95℃ 5sec，60℃退火 30sec，30个循环）。最后制作标准曲线，检测各证型HLAA24、CW1基因含量。

4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD进行各组均数多重比较，相关性分析采用线性相关分析法。P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 慢性乙型肝炎中医证型分布情况

慢性乙型肝炎患者的常见证型为瘀血阻络型和肝胆湿热型，分别各占32%和25%，性别比例中以男性占比较多，为90%，女性占比为10%，中医证型分布于性别的差异无统计学差异，见表1。

表1 98例慢性乙型肝炎患者不同性别中医证型 分布情况

2 各证型HBV-DNA、ALT及AST定量结果比较

HBV-DNA定量结果以肝胆湿热及肝郁脾虚证型较高，肝肾阴虚、瘀血阻络及脾肾阳虚证型较低，各组相比较差异均无统计学意义（P>0.918）；ALT结果各组间比较，脾肾阳虚证型高于与其他各证型（P<0.05），即脾肾阳虚证>肝胆湿热证> 肝郁脾虚证>瘀血阻络证>肝肾阴虚型；AST结果各组间相比较，尤以脾肾阳虚为最高，且高于其它证型（P<0.05），其次为肝郁脾虚、瘀血阻络、肝胆湿热及肝肾阴虚证，见表2。

表2 各证型HBV-DNA、ALT及AST值比较 （±s）

表2 各证型HBV-DNA、ALT及AST值比较 （±s）

注： 与其它组比较，* P<0.05

证型分类 例数 HBV-DNA/U·ml-1 ALT/U·L-1 AST/U·L-1肝胆湿热型 24 2.13±0.70 44±16.92 42±10.62肝郁脾虚型 15 2.03±0.66 41±10.56 63±16.99*肝肾阴虚型 18 1.64±0.68 34±9.85 31±8.04瘀血阻络型 31 1.72±0.46 35±8.46 44±10.09脾肾阳虚型 10 1.70±0.95 62±11.25* 115±40.24*

3 各证型HLA-A24，HLA-CW1基因检测结果比较

各证型HLA-A24基因表达以正常对照组表达最高，脾肾阳虚证型表达最低，肝胆湿热证、肝肾阴虚证、瘀血阻络证及脾肾阳虚证型与正常组比较，差异有统计学意义（P<0.05），肝郁脾虚证与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；HLA-CW1基因表达以对照组表达结果最高，肝胆湿热证型表达最低，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），而其它各组结果比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 各证型HLA-A24及CW1结果 （±s）

表3 各证型HLA-A24及CW1结果 （±s）

注：与正常对照比较，*P<0.05

证型分类 例数 HLA-A24 HLA-CW1肝胆湿热型 15 2.32±1.62* 1.81±1.21*肝郁脾虚型 18 3.23±1.95 2.71±1.86肝肾阴虚型 31 2.46±1.63** 2.28±1.20瘀血阻络型 10 2.48±1.73* 2.05±1.55脾肾阳虚型 24 1.19±0.91* 2.66±1.75对照组 40 4.10±1.69* 2.89±1.68*

4 各客观指标相关性分析

应用SPSS17.0将各相关因素进行分析，ALT和AST与HBV-DNA呈显著正相关（P<0.05），HLA-CW1与HLA-A24基因成显著正相关（P<0.05），见表4。

表4 各组HBV-DNA、ALT、AST、HLA-A24及CW1相关性分析

讨 论

中医学认为乙型病毒性肝炎属于“黄疸”“胁痛”“积聚”“鼓胀”“郁证”等疾病范畴，归因于疫毒浸淫肝胆，而肝疏泄失常，无法鼓邪外出，导致湿热疫毒留滞体内而发病[4]。ALT和ASTS是反映肝功能最常见的两个指标，ALT主要存在于肝细胞浆中，当宿主被感染乙肝病毒后，肝细胞在病毒的侵蚀下表现为通透性增加，ALT从肝细胞逸出，从而引起肝细胞变性损伤，引起一系列临床症状；AST主要分布于肝细胞线粒体中，少数分布于细胞质中，当肝细胞病变严重甚至坏死时，AST即会从肝细胞线粒体中释放出来到血液中被检测出来；在临床上，HBV-DNA是检测HBV感染最直接而特异性又很高的指标，通常载量越高，表示病毒复制越厉害，传染性越强。本研究发现慢性乙型肝炎中医证型主要以肝胆湿热和淤血阻络证型较为多见，分别为24%和32%，这与陈瑞年的研究[5]中以湿热内结和肝郁脾虚证型占比最多的结果有差异，可能与本研究收集的样本数过少有关；ALT在脾肾阳虚及肝胆湿热证型中值大于正常参考范围，与其它证型之间相比较有统计学意义（P<0.05），AST则是在脾肾阳虚及肝郁脾虚证型中表现为大于正常参考范围，与另外三种证型相比较有统计学意义（P<0.05），表明脾肾阳虚证型肝细胞损伤比较严重，其次为肝郁脾虚，肝胆湿热，肝肾阴虚和淤血阻络证型，这与刘二丽的研究[6]ALT和AST在湿热内结和脾肾阳虚证型明显升高的结果一致，与吴礼锋的研究[7]有一些差异；本研究中各证型HBV-DNA的结果以肝胆湿热和肝郁脾虚证型较高，各证型之间相比较结果无统计学意义，结果与黄继琴[8]、姜楠[9]的研究结果一致。相关性分析发现ALT和AST与HBV-DNA呈显著正相关（P<0.05），表明肝胆湿热证型在早期会出现肝细胞损伤，随着病情进展，到了肝郁脾虚、肝肾阴虚、淤血阻络和脾肾阳性证型后，宿主驱邪无力，邪毒聚增，造成肝细胞损伤从细胞浆到线粒体，进而大量病毒释放到血浆中，出现了HBV-DNA拷贝数增加的病况，而HBV-DNA拷贝数的增减则慢性乙型肝炎治疗的一个指标。

人 类 白 细 胞 抗 原（Human Leukocyte Antigen，HLA）是一组由具有高度多态性和连锁不均衡的基因群体而构成的人类主要组织相容性复合体，也是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统。Ayse Albayrak等将257例土耳其人分为对HBV疫苗有应答组和无应答组，发现应答组的HLA-A24基因频率显著高于无应答组[10]，即HLA-A24基因与宿主对乙肝疫苗的反应性有关。亦有研究表明，HLA-A24与CW1与临床应用利巴韦林治疗的转归息息相关[11]，宿主自身的HLA-A24与HBV相关性慢性肝炎呈低风险关系[12]。本研究中各证型与自动产生乙肝保护性抗体的对照组相比较，差异有显著的统计学意义（P<0.05），脾肾阳虚证型结果最低，而肝胆湿热、肝郁脾虚、肝肾阴虚及瘀血阻络证型结果相对较高，也证实了HLA-A24基因与疫苗的反应性及病程的转归均有关联性。本研究中的HLA-CW1结果以肝胆湿热证型最低，与其它证型相比较，差异有统计学意义（P<0.05），表明慢性乙型病毒性肝炎的病程发展是肝胆湿热-肝郁脾虚-肝肾阴虚-瘀血阻络-脾肾阳虚这样一个路径。

宿主感染HBV后，即湿热疫毒侵入机体，是乙型肝炎慢性化的外因与宿主自身的免疫因素相互作用，即邪正交争，根据其各自的力量交锋后，出现彼此消长盛衰的变化，导致了病毒感染宿主后不同的发展和转归。起始阶段肝郁脾虚、肝胆湿热阶段为自身免疫

功能与病毒处于正邪相交的阶段，可能此时及时治疗应该是比较合适的时机，通过检测宿主自身HLA基因亦可为临床注射HBV疫苗是否出现应答，甚至判断药物的疗效提供一个方向性指导。