大豆蛋白素肠复配防腐剂的配方研究

高玉龙 姚现琦 吴 昊 金维忠 卢绪志 陈祥礼 丁国家 王 欢

临沂金锣文瑞食品有限公司 山东临沂 276036

香肠因其美味、营养丰富和方便食用等特点，深受广大消费者的青睐，是市场上销量最大的熟肉制品之一[1，2]。目前市售的香肠主要是以肉馅为原料生产的，由于肉类中含有较多的脂肪、胆固醇和热量，过量摄入会引起一定的健康风险。因此香肠市场亟待开发迎合当下健康理念的新产品。

大豆蛋白是一种优质的植物蛋白，其丰富的营养和保健价值早已为消费者共知。早在1999年10月美国食品与药品监督管理局(FDA)就公布了大豆蛋白的健康声明：每天摄入包含25g大豆蛋白的低脂肪低胆固醇的食品，可以明显地降低患心脏病的风险。自此之后，大豆蛋白及其加工制品逐渐成为众多科研机构及生产企业研究开发的热点[3]。其中大豆蛋白素肠是以大豆分离蛋白为主要原料制成的一种新型豆制品，其具有营养丰富，不含胆固醇，不含反式脂肪酸的特点，非常符合当代消费者对健康饮食的追求。但是，在大豆蛋白素肠生产的过程中除了进行常规的热杀菌外，符合GB 2760-2014的防腐剂只有山梨酸及其钾盐、ε-聚赖氨酸盐酸盐、丙酸及其钠盐、钙盐少数几种防腐剂[4]。由于食品卫生安全标准不断提高，在现有的生产工艺下就出现了微生物控制难的问题。

本研究是在GB 2760-2014允许食用的防腐剂范围内，通过防腐剂的复配，达到控制微生物生长并降低防腐剂用量，提高食品安全性并降低企业生产成本的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

山梨酸钾，食品级，金能科技股份有限公司；

丙酸钙，食品级，山东省同泰维润食品科技有限公司；

ε-聚赖氨酸盐酸盐，食品级，浙江新银象生物工程有限公司；

营养琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；

营养肉汤培养基，广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平JH3100-2，北京京衡伟业科技有限公司；

斩拌机BZBJ-40，中国艾博公司；

真空搅拌机KRJB-150，嘉兴市凯润机械制造有限公司；

填充机BHDK-2008，北京航天东方科技公司；

生化培养箱LRH-250，上海一恒科学仪器有限公司；

恒温震荡培养箱ZHWY-2102C，上海志诚设备公司；

立式蒸汽灭菌锅DGL-50B，江苏登冠医疗器械有限公司；

超净工作台BBS-DDC，济南鑫贝西生物技术有限公司；

PH计PHS-3C，上海雷磁；

紫外可见分光光度计UV-2550，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 腐败菌的分离鉴定与增菌

取室温下腐败变质的大豆蛋白素肠产品1g，切碎，放入盛有10mL无菌水的离心管中，密封，震荡10min,使用无菌滤纸过滤除去残渣，保留菌液备用，采用稀释涂布平板法将菌液涂布到营养琼脂培养基上进行培养，此实验全程在无菌操作条件下进行，涂布均匀后于37℃恒温培养箱中培养18～24h。根据菌落形态特征，从含菌平板上挑取形态特征不同的单个菌落，进行平板划线并在37℃恒温培养箱中培养18～24h，观察单个菌落形态，如色泽、大小、边缘整齐与否等,挑取菌种进行革兰氏染色[5],并在显微镜下观察染色情况[6]。挑取菌种接种于营养肉汤培养基中，于37℃，150r/min恒温震荡培养箱中增菌16～18h，将菌液用无菌水稀释一定的倍数，采用血球计数板计数，得出菌体浓度，并将培养液稀释成菌体浓度为107cfu/ml的菌悬液，4℃冰箱暂存备用[7]。

1.2.2 防腐剂添加限量分析

根据GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对大豆蛋白素肠中防腐剂的添加限量总结如下表1。

表1 不同防腐剂在大豆蛋白素肠产品中使用限量

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定

将山梨酸钾、ε-聚赖氨酸盐酸盐、丙酸钙用无菌水配制成质量浓度为30mg/mL的溶液，无菌过滤，4℃保存备用。测定大豆蛋白素肠正常产品的pH值为6.1～6.5之间[8]，并相应的将营养肉汤培养基的pH调节至相应的值，分装至250mL锥形瓶中，100mL/瓶，灭菌后备用。

将山梨酸钾母液分别加入到灭菌后的培养基中，使山梨酸钾(山梨酸计)的最终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL。

将ε-聚赖氨酸盐酸盐母液分别加入到灭菌后的培养基中，使ε-聚赖氨酸盐酸盐的最终浓度为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.27、0.30mg/mL。

将丙酸钙母液分别加入到灭菌后的培养基中，使丙酸钙(以丙酸计)的最终浓度为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50mg/mL。

在上述培养基中分别接入1mL菌悬液，每个浓度3个平行，37℃，150r/min振荡培养24h,用无菌水代替防腐剂作为阳性对照，用液体培养基代替菌液作为阴性对照。以空白参比为阴性对照，在620nm波长处测OD值。

1.2.4 防腐剂的复配

根据最小抑菌浓度试验结果，针对大豆蛋白素肠腐败菌，选取抑菌效果较好的若干种防腐剂，进行复配。以山梨酸钾和ε-聚赖氨酸盐酸盐为例，分别取1/2、1/4、1/8MIC 3个浓度水平，设计营养肉汤培养基中的防腐剂添加量，并相应的将营养肉汤培养基的pH值调节至6.1～6.5，分装至250mL锥形瓶中，100mL/瓶，灭菌后备用。接种、培养基检测方法与最小抑菌浓度(MIC)的测定中相同。

通过公式计算出部分抑菌浓度指数(FICI)来判断2种防腐剂相互作用。

(1)

其中，MICAalone和MICBalone分别表示2种化合物A和B单独使用的时候的MIC值，CAcomb和CBcomb为2种化合物联合使用时达到相同药效(等效位点)时各自的浓度。当FICI≤0.5，证明2种防腐剂对于测定菌株有协同作用，当FICI指数为0.5～1时，2种防腐剂相加作用；当FICI指数大于l且小于2时，2种防腐剂为无关作用；当FICI指数大于2时，2种防腐剂为拮抗作用[9]，FICI越小，2种防腐剂复配的协同作用就越强。

1.2.5 复配防腐剂延长产品货架期验证

将具有协同增效作用的复配防腐剂组合按照相同的添加量添加到大豆蛋白素肠中。同时以添加MIC浓度单一品种防腐剂作为对照，常温下进行货架期验证。大豆蛋白素肠按照正常生产工艺制作，使用PVDC肠衣填充，107℃杀菌30min，每组试验30支平行样品，以是否发生涨袋作为判断货架期的标准，每天观察记录涨袋情况。

2 结果与讨论

2.1 腐败菌的分离与初步鉴定

通过单菌落分离和菌种纯化共获得腐败菌3株：fb1、fb2、fb3，将其活化后，稀释涂布在平板上，37℃恒温培养箱中培养18～24h后观察单个菌落形态，如色泽、大小、边缘整齐度等。同时挑取单个菌落进行革兰氏染色并进行镜检，结果如表2。

表2 腐败菌鉴定结果

2.2 不同防腐剂最小抑菌浓度(MIC)的确定

山梨酸钾对腐败菌的最小抑菌浓度见表3。

表3 山梨酸钾(以山梨酸计)对腐败菌的最小抑菌浓度

本研究通过对比不同山梨酸钾添加量对3株腐败菌生长抑制情况的研究，获得如表3所示的结果：山梨酸钾对腐败菌fb1的MIC为0.9mg/mL，对fb2和fb3的MIC的最小抑菌浓度都为0.7mg/mL。由此分析得出山梨酸钾对fb2和fb3的抑菌效果明显好于对fb1的抑菌效果，腐败菌fb1对于山梨酸钾具有更强的耐受性。

ε-聚赖氨酸盐酸盐对腐败菌的最小抑菌浓度见表4。

表4 ε-聚赖氨酸盐酸盐对腐败菌的最小抑菌浓度

通过对不同梯度浓度的ε-聚赖氨酸盐酸盐下腐败菌fb1、fb2和fb3的生长情况的比较，获得如表4所示的结果：ε-聚赖氨酸盐酸盐对腐败菌fb1的MIC为0.18mg/mL，对腐败菌fb2的MIC为0.24mg/mL，对腐败菌fb3的MIC为0.21mg/mL；腐败菌fb1、fb2和fb3对ε-聚赖氨酸盐酸盐耐受性为fb2>fb3>fb1。

丙酸钙对腐败菌的最小抑菌浓度见表5。

表5 丙酸钙(以丙酸计)腐败菌的最小抑菌浓度

通过比较不同梯度浓度的丙酸钙对腐败菌fb1、fb2和fb3的抑制情况，得出如表5的结果：丙酸钙对腐败菌fb1的MIC为2.5mg/mL，对腐败菌fb2的MIC为2.25mg/mL，对腐败菌fb3在允许添加量范围内不能起到抑菌作用。产生上述结果的原因，推测为丙酸钙是酸型食品防腐剂，在酸性条件下，产生游离丙酸，具有抗菌作用，其抑菌作用受环境pH值的影响，pH值6.0时抑菌能力明显降低[10]，在植物蛋白素肠的pH值范围内(6.1～6.5)，防腐抑菌效果较低。

2.3 复配防腐剂对腐败菌的抑制作用

由以上实验结果得出，单一的防腐剂，不能够对所有的大豆蛋白素肠腐败菌产生良好的抑菌效果，需要将不同的防腐剂进行复配才能获得提高抑菌能力降低防腐剂添加量的效果。本研究在上述实验结果的基础上选择效果相对较好的山梨酸钾和ε-聚赖氨酸盐酸盐进行复配，并分别测定对3株腐败菌fb1、fb2、fb3的抑制能力。

由上表6～表9得出，不同的山梨酸钾与ε-聚赖氨酸盐酸盐复配浓度组合对于fb1、fb2、fb3具有不同的抑制作用，当山梨酸钾与ε-聚赖氨酸盐酸盐分别最小抑菌浓度为1/8和1/2、1/8和1/4、1/8和1/8时不能抑制fb1的生长，在1/8和1/4、1/8和1/8时对fb1的抑制具有协同增效作用；当山梨酸钾与ε-聚赖氨酸盐酸盐分别最小抑菌浓度的1/2和1/8、1/4和1/8、1/8和1/8时不能抑制fb2的生长，在1/4和1/4、1/8和1/4时对fb2的抑制具有协同增效作用；当山梨酸钾与ε-聚赖氨酸盐酸盐分别最小抑菌浓度的1/8和1/4、1/8和1/8时不能够抑制fb3的生长，在1/4和1/4、1/4和1/8时对fb3的抑制具有协同增效作用。

表6 山梨酸钾(以山梨酸计)与ε-聚赖氨酸盐酸盐复配对fb1的抑菌效果Table 6 The inhibitory effect of potassium sorbate (based on sorbic acid) and ε- polylysine hydrochloride on fb1

表7 山梨酸钾(以山梨酸计)与ε-聚赖氨酸盐酸盐复配对fb2的抑菌效果

表8 山梨酸钾(以山梨酸计)与ε-聚赖氨酸盐酸盐复配对fb3的抑菌效果

表9 山梨酸钾(以山梨酸计)与ε-聚赖氨酸盐酸盐的复配抑菌活性

2.4 复配防腐剂延长货架期验证结果

本研究选择上述实验中，对腐败菌具有协同增效作用的山梨酸钾与ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度组合，与添加MIC浓度的单一品种防腐剂作对比试验，以不添加任何防腐剂产品为空白对照，常温条件下储藏进行货架期验证试验得到如表10所示的结果。

表10 不同复配防腐剂组合与单一品种防腐剂延长货架期对比

由表10得出，添加单一品种的防腐剂，能够起到一定的防腐效果，例如，添加0.9mg/g的山梨酸钾(以山梨酸计)，能够将大豆蛋白素肠的货架期，由空白对照的60.15d延长到93.21d；添加0.24mg/g的ε-聚赖氨酸盐酸盐可以将大豆蛋白素肠产品的货架期延长到98.48d，但是添加单一品种的防腐剂，往往会出现添加量大，但防腐效果却相对较差的缺点。本研究出的添加0.175mg/g山梨酸钾+0.06mg/g ε-聚赖氨酸盐酸盐可以将货架期延长到120.45d,添加0.175mg/g山梨酸钾+0.0525mg/g ε-聚赖氨酸盐酸盐也能够将货架期延长到107.49d，其他复配组合也能够达到与单一品种防腐剂接近的效果，与此同时防腐剂的相对添加量却大大降低。

3 结论

随着食品安全标准的不断提高以及消费者对于食品安全的重视，有效并且安全的防腐技术正越来越成为食品研究机构的研究热点。本研究通过分离大豆蛋白素肠腐败菌并有针对性地筛选验证在GB2760-2014中允许添加的3种防腐剂的防腐性能，在此基础上通过复配，获得的复配防腐剂不仅能够起到延长货架期的效果，还能够降低防腐剂的相对添加量，在提高了食品安全性的同时，降低了食品生产企业的成本。同时本研究中针对特定腐败菌研究并优化防腐剂配比的方法，也较大的缩短了试验和开发周期，对其他种类产品专用防腐剂的开发有一定的借鉴价值。