HPLC 法同时测定消肿止痛颗粒中5种成分

毕映燕李盛华李喜香刘效栓

（甘肃省中医院，甘肃 兰州730050）

消肿止痛颗粒（甘药制字Z04000844）为甘肃省名中医、陇中正骨流派学术带头人李盛华主任医师集数十年经验而制成，由当归、生地黄、青皮、白芍、泽兰、红花、木香、川芎、水蛭、甘草等12 味中药组成，具有祛风除湿、活络止痛功效，用于治疗肝肾亏虚、筋脉瘀滞型骨痹，而骨性关节炎也属于中医“骨痹”范畴［1］。课题组前期采用D⁃混料设计对消肿止痛颗粒制备工艺进行优化，建立了物理指纹图谱以控制其外在质量［2］，但目前其质量标准仅以芍药苷含量为质量控制指标，不能完全反应其内在质量［3］。

现代药理研究证实，白芍中芍药苷、当归中阿魏酸、甘草中甘草苷具显著抗炎活性［4⁃6］，对骨性关节炎具有积极保护作用；青皮中橙皮苷是治疗关节炎类药物的质量标志物［7］；熟地黄中毛蕊花糖苷是其特有抗炎药效成分，可调节骨代谢［8］。因此，本实验选取芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷作为指标成分，建立HPLC 法同时测定其含量，以期为全面控制消肿止痛颗粒质量及二次开发提供参考。

1 材料

Agilent 1206型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；125SM型电子天平（德国Satorius 公司）；HS6150型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。芍药苷（批号110736⁃200629）、阿魏酸（批号110773⁃201614，纯度99.0%）、毛蕊花糖苷（批号11530⁃201713，纯 度 92.5%）、甘草苷（111610⁃201005，纯度94.9%）、橙皮苷（110721⁃201115，纯度95.3%）对照品均购于中国食品药品检定研究院。消肿止痛颗粒（20200101，20200102，20200103）由甘肃省中医院科研制剂中心提供。甲醇（色谱纯，山东禹王集团化工分公司）；甲醇（分析纯，天津市博迪化工有限公司）；磷酸（色谱纯，天津大茂化学试剂厂）；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Symmetry Shield⁃C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）⁃0.1%磷酸（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长230 nm（0～30 min）、330 nm（30～51 min）、230 nm（51～55 min）、280 nm（55～64 min）；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 系统适用性考察 精密吸取芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷混合对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定5 次，测得5种成分峰面积RSD分别为0.85%、0.95%、0.42%、1.05%、1.1%；理论塔板数以芍药苷计应不低于5 000，分离度均大于1.5。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液 精密称取干燥至恒定质量的对照品适量，甲醇溶解，制备成每1 mL分别含芍药苷1.61 mg、阿魏酸0.33 mg、甘草苷2.00 mg、毛蕊花糖苷0.462 mg、橙皮苷1.04 mg 的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液 取颗粒适量，研细，精密称取5.0 g，置于50 mL 三角瓶中，加25 mL 甲醇，称定质量，25 ℃下超声（300 W、25 kHz）处理45 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.3 阴性样品溶液 按照处方工艺，制得缺白芍、当归、地黄、甘草、陈皮的阴性样品，按“2.3.2”项下方法制备，即得。

2.4 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分分离度理想，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 线性关系考察 精密吸取“2.3.1”项下对照品溶液适量，甲醇稀释成每1 mL分别含芍药苷20.125、40.25、80.5、161、201.25 μg，阿魏酸4.125、8.25、16.5、33、41.25 μg，甘草苷25、50、100、200、250 μg，毛蕊花糖苷 5.775、11.55、23.1、46.2、57.75 μg，橙皮苷13、26、52、104、130 μg 的溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，每个质量浓度3 次。以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，记录峰面积，测得芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷日间、日内精密度RSD分别为0.75%、1.14%，0.95%、1.02%、1.13%及1.56%，0.88%、0.91%，0.78%、1.23%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，于0、4、8、12、18、24 h 在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷峰面积RSD分别为1.08%、1.68%、1.26%、1.55%、1.23%，表明溶液 在24 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验 取同一批颗粒（批号20200101）6 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷峰面积 RSD分别为1.36%、1.95%、1.72%、1.93%、1.56%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的颗粒（批号20200101）2.5 g，共6 份，按100%水平精密加入对照品溶液适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.10 样品含量测定 取3 批颗粒（批号20200101、20200101、20200101），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 讨论

3.1 检测波长确定 本实验在190～400 nm 波长处对芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷进行全波长扫描，发现其最大吸收波长分别为230、323、334、237、274 nm，最终选择波长切换方式［9］，可降低杂质对色谱峰的干扰，从而实现多成分含量的同时测定。

3.2 流动相、柱温、色谱柱确定 本实验考察了甲醇、乙腈及不同体积分数磷酸、醋酸［10⁃14］，发现以甲醇⁃水（含0.1% 磷酸）为流动相时色谱峰分离度和峰型良好。芍药苷峰形随柱温变化较明显，高于25 ℃时色谱峰拖尾明显，而低于25 ℃时其对称性理想。同时，考察了Agilent C18、Waters C18等色谱柱，发现5种成分峰形相近，即两者均可用于含量测定［15］。

3.3 提取方法、溶剂及提取时间确定 本实验比较了超声、回流提取，发现两者对5种成分的提取率相差不大，故选择操作更简便的前者作为提取方法。再对提取溶剂进行了筛选，发现以含水甲醇提取时会溶解了一定量糊精与糖粉，导致基线噪音较大［15］，不利于5种成分含量测定，故选择甲醇。然后，比较了提取时间15、30、45、60 min，发现超声45 min 后提取率最高。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定消肿止痛颗粒中芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷的含量，该方法简便可行［17］，可用于该制剂质量控制，也为其他医院制剂质量标准的提升提供参考。