复方丹参制剂中7种成分在大鼠血浆中的药动学研究

孙晶晶殷 玮凌 珊彭佳裕蔡文镇倪庆纯

（广州医药研究总院有限公司，广东 广州510240）

复方丹参制剂是以丹参、三七为主要成分的复方制剂，为我国治疗心血管疾病的常用中药，已有至少30年的应用历史［1⁃4］，主治气滞血瘀所致的胸痹，以及胸闷、心前区刺痛、冠心病心绞痛见上述证候者，对冠心病、心绞痛、动脉粥样硬化有很好的疗效［5⁃7］，但同时也伴有胃肠道反应、头痛、出血等不良反应［8⁃10］。方中丹参主要成分包括丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸A～G 等水溶性酚类化合物，以及丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮等脂溶性二萜类化合物；三七主要含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1 等皂苷类成分，具有不同的药理活性［11⁃18］。

目前，已有对丹参、三七体内血药浓度分别进行检测的报道［19⁃22］，或对复方丹参制剂中不同成分进行血浆前处理［23］、在不同色谱条件下进行分离检测［24］，但操作复杂繁琐。因此，本实验建立高效液相色谱串联质谱（LC⁃MS／MS）法测定复方丹参制剂中丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的血药浓度，该方法简便、快速、灵敏、特异性高，可用于相关药动学研究。

1 材料

1.1 仪器 Sciex Qtrap 5500 质谱仪串联Shimadzu LC 30AD 液相色谱仪，配置四极杆质谱仪配电喷雾离子源（ESI）；Sigma3⁃18K 高速低温离心机（德国Sigma 公司）；氮吹仪（八方世纪科技有限公司）；旋涡振荡器；精密移液枪（德国Eppendorf 公司）。

1.2 试剂与药物 丹酚酸B、丹参素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1 对照品（中国食品药品检定研究院，纯度均＞98%）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（德国Merck 公司，纯度分别≥99.8%、99.9%、99.8%）；甲酸（阿拉丁控股集团有限公司，纯度≥98%）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 XBridge BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相水（含0.1% 甲酸）（A）⁃甲醇（B），梯度洗脱（0～0.5 min，10%～95%B；0.5～2.0 min，95%B；2～2.2 min，95%～10%B；2.2～3.0 min，10% B）；体积流量0.30 mL／min；柱温40 ℃；自动进样器温度8 ℃；进样量3.00 μL。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；正负离子模式（Positive／Negative）；多反应监测（MRM）；气帘气（CUR）25 psi（1 psi ＝0.133 kPa）；离子源气体1（Gas1）50 psi；离子源气体2（Gas2）50 psi；离子源喷雾电压（IS）5 500 V；离子源温度（TEM）550 ℃；分辨率Q1／Q3（Resolution Q1／Q3）Unit／Unit；碰撞气（CAD）Medium；暂停时间（MR Pause）20 ms；质谱采集时间3.00 min；去簇电压120.0 V；入口电压10.00 V；出口电压25.00 V；停留时间100.0 ms。离子对、碰撞能见表1。

表1 各成分、内标的离子对和碰撞能Tab.1 Ion pairs and collision energies of various constituents and internal standard

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液 称取丹酚酸B、丹参素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1 对照品适量，溶于80% 甲醇中，即得（质量浓度为1.00 mg／mL）。

2.3.2 内标溶液 称取卡马西平对照品适量，溶于80%甲醇中，即得（质量浓度为1.00 mg／mL）。

2.4 血浆样本前处理 精密吸取大鼠血浆50 μL，加入内标（卡马西平）50 μL（200 ng／mL），涡旋1 min 后充分混匀，再加入600 μL 乙酸乙酯⁃正己烷（3∶1）混合溶液萃取，涡旋10 min 后4 ℃、5 000 r／min 下离心10 min，取上清液400 μL，室温下氮气吹干，再加入150 μL 80%甲醇复溶，涡旋5 min，5 000 r／min 离心5 min，取上清液进样分析。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 取空白血浆、空白血浆＋对照品（4.00 ng／mL）＋内标、给药8 h 后血浆，按“2.4”项下方法处理，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，丹酚酸B、丹参素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、内标（卡马西平）保留时间分别为1.56、0.62、1.87、1.92、1.63、1.65、1.74、1.68 min，各成分之间分离度良好，在相应离子通道中不受内源性物质干扰。

图1 各成分代表性色谱图Fig.1 Representative chromatograms of various constituents

2.5.2 线性关系考察 用80%甲醇将1.00 mg／mL对照品溶液进行稀释，得到相应质量浓度的标准曲线工作溶液及混合质控样本工作溶液。向380 μL空白血浆中加入上述溶液各20.0 μL，混合均匀，得到标准曲线血浆样本及质控血浆样本，按“2.4”项下方法处理，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定。以血浆中各成分质量浓度（ng／mL）为横坐标（X），各成分与内标物峰面积之比为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.3 提取回收率试验 用低、中、高质量浓度质控样本配制6个样品，同时提取18个不含待测物但含有内标的对照样本（混合基质），在提取液中加入各成分并保证与各提取样本的理论质量浓度一致，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算提取回收率，提取回收率＝（C／S）×100%，其中C为质控样本中待测物峰面积，S为对照样本中待测物峰面积，结果见表3。

2.5.4 基质效应试验 取6个来源的空白基质，按“2.4”项下方法处理，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，于空白血浆上清液中加入各成分和内标，计算含基质、不含基质样品峰面积的比值和基质因子，内标归一化法分析基质效应，结果见表3。

2.5.5 精密度试验 配置定量下限及低、中、高质量浓度的质控血浆样本，平行6 份，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定3 d，根据当日标准曲线计算质量浓度，结果见表3。

表3 各成分精密度、提取回收率、基质效应试验结果（n＝6）Tab.3 Results of precision， extraction recovery and matrix effect tests for various constituents（n＝6）

2.5.6 稳定性试验 通过分析质控样品在室温下保存12 h 来确定短期稳定性，通过分析质控样品在4 ℃下保存24 h 来确定自动进样器稳定性，通过分析质控样品在－80 ℃下冻融循环3 次后与新制备的相同质量浓度样品进行比较来确定冻融循环稳定性，通过分析质控样品在－80 ℃下储存1个月后与新制备的相同质量浓度样品进行比较来确定长期稳定性，结果见表4。

表4 各成分稳定性试验结果Tab.4 Results of stability tests for various constituents

2.5.7 药动学研究 称取片剂适量，加入0.9%氯化钠注射液制成混悬液，摇匀待用。6 只大鼠灌胃给予上述混悬液，给药剂量为4.0 g／kg，于给药前及给药后10、20、30、60、120、240、360、480、1 440、2 880 min 眼眶采血各0.3 mL，置于肝素化试管中，2 000×g离心15 min，分离血浆，置于－80 ℃冰箱中保存，按“2.4”项下方法处理，绘制血药浓度⁃时间曲线，通过DAS 3.0 软件计算药动学参数，结果见图2、表5。

图2 各成分血药浓度⁃时间曲线Fig.2 Plasma concentration⁃time curves for various constituents

表5 各成分主要药动学参数Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for various constituents

3 讨论

本实验仪器采用超高压液相色谱，样本分析时间缩短到3 min；质谱采用MRM 模式，具有高灵敏度、高选择性；采用梯度洗脱，可使内标和待测物保留时间接近，并避免基质效应；流动相采用0.1%甲酸作为水相，可提高待测物的响应，甲醇作为有机相，色谱峰形较好；样本前处理过程中曾尝试采用蛋白沉淀法和液液萃取法，其中前者分别以甲醇、乙腈为沉淀剂，发现多种成分回收率不够理想，后者分别以乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、与环己烷混合的溶剂进行提取，发现乙酸乙酯⁃正己烷（3∶1）的提取效率最高，最终采用该溶剂进行液液萃取，吹干后复溶进样。

药动学实验显示，丹参素、人参皂苷Rb1 在大鼠体内的Cmax、AUC0～t相对较高，是主要入血成分；人参皂苷Rb1、丹参酮Ⅰ在大鼠体内的消除半衰期、平均滞留时间较长，而三七皂苷R1 两者较短，其余比较接近，与文献［23⁃25］报道接近，揭示了不同成分体内维持时间，可为研究复方丹参制剂体内作用规律提供依据。