免疫球蛋白对蛛网膜下腔出血大鼠海马神经元损伤修复的作用

刘 涛 李玉强 王贤君 张泽立（山东省济南市第三人民医院神经外科，济南250132）

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是常见出血性脑血管疾病，致死率极高，流行病学研究显示，美国脑血管疾病患者中约5%为SAH，且发病率呈上升趋势［1］。SAH后神经元损伤及迟发性脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CV）是导致SAH患者死亡及残疾的主要原因，而神经元损伤、CV发生受氧化应激、炎症反应及神经元细胞凋亡等影响［2］。研究显示，控制SAH患者病情，预防再出血、血管痉挛及脑积水等并发症，是降低SAH致残率及致死率的关键［3］。临床常采用抗纤维蛋白溶解液、钙通道阻滞剂、甘露醇、镇静药物等常规药物治疗SAH，虽然可一定程度缓解患者临床症状，但效果并不理想，暂时尚无特效防治药物［4］。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）不仅可与抗原特异性结合，还具有固定补体、调理单核巨噬细胞吞噬能力功能；此外，研究显示，Ig可非特异性增强抑制性T细胞功能，间接抑制炎症因子产生［5-6］。Ig对脑外伤、脑出血等多种疾病具有神经保护作用，但其对SAH神经元的保护作用及具体机制尚未明确。本研究建立SAH大鼠模型，给予不同剂量Ig治疗，观察Ig对大鼠SAH的影响，为SAH治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性清洁级SD大鼠50只，购自山东大学医学院动物实验中心，6～9周龄，平均（7.05±1.02）周，体重0.17～0.24 kg，平均（0.21±0.03）kg，标准环境下饲养，每12 h昼夜交替1次，饮水及食物充足。

1.1.2 主要试剂 Ig购自四川远大蜀阳药业（300 mg/瓶）；TUNEL凋亡试剂盒购自万类生物公司；抗胱天蛋白酶3（cysteinyl aspartate-specific proteinase-3，caspase-3）抗体购自深圳达科为生物技术有限公司；磷酸化氨基末端蛋白激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，P-JNK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化c-Jun（phosphorylated c-Jun，p-c-Jun）购自美国Sigma公司；免疫组织化学试剂盒购自北京中杉会桥生物技术有限公司；蛋白分析试剂盒及发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器 切片架购自德国莱卡公司；JW-3021HR型高速台式离心机购自安徽嘉文仪器装备公司；显微镜购自日本OLYMPUS公司；EppendollF移液器购自广州威佳公司；石蜡切片机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪购自常州中威电子仪器厂；S60电热恒温水温箱购自北京市医疗设备厂；AniRes2005软件分析系统购自北京贝兰博科技有限公司；培养箱购自双捷实验仪器厂；外科手术器械购自上海市器械厂；电子秤及低温冰箱购自北京正开仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及处理 SD大鼠常规适应性饲养7 d，随机选择10只作为空白对照组，剩余40只建立SAH模型，建模成功后随机分为4组，每组10只，分别设为模型组、Ig低剂量［0.2 g/（kg·d）］组、Ig中剂量［0.3 g/（kg·d）］组、Ig高剂量［0.4 g/（kg·d）］组。

1.2.2 造模 采用枕大池自体血二次注血法制作模型，所有大鼠进食12 h后，称重，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg），常规消毒铺巾，大鼠取仰卧位固定于手术台，手轻触大鼠股动脉，沿动脉波动边缘剪开大鼠皮下组织，分离血管神经，充分暴露于右侧股动脉，备用，于即将穿刺点近心端预留结扎线，棉球压迫止血；取大鼠俯卧位，暴露枕外隆突，沿该方向作3 cm左右切口，仔细分离肌肉，充分暴露枕环膜，采用事先经肝素钠盐水冲洗后的注射器从右侧股动脉抽取0.3 ml左右血液，并通过预留线结扎；于3 min内沿环枕膜缓慢注入，针头拔出后，采用明胶海绵封闭针口，逐层缝合切口。24 h后采用同样方式抽取另一侧股动脉血液注入枕大池。完成后，取头低位30 min，便于血液均匀分布于蛛网膜下腔；空白对照组颅内注入0.3 ml生理盐水；制备完成后，密切关注大鼠行为及饮食情况。建立大鼠SAH模型手术结束后48 h，将所有大鼠按照上述办法麻醉后，取仰卧位，剪开胸腔、左心室，插入导管固定，剪开右心耳，快速灌流，首先灌流生理盐水500 ml，排空全身血液，后灌入4%多聚甲醛500 ml，结束后开颅取脑，置于多聚甲醛溶液中固定48 h，取海马组织，石蜡包埋切片，备用。

1.2.3 尼氏（Nissl）染色观察大鼠神经元破坏情况 取常规石蜡包埋的大鼠海马组织，切4 um片，浸入0.5%明胶中，用毛刷将组织片贴到载玻片上，自然风干；常规脱蜡水化后，将组织片置于0.5%甲苯胺蓝或焦油紫中室温下染色30 min，蒸馏水冲洗3次，依次浸入75%、80%、95%乙醇中；置于特殊分色液中分色15 s，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.4 TUNEL染色检测细胞凋亡 切片常规脱蜡、水化，30 ml/L过氧化氢抑制内源性过氧化氢酶；切片浸泡于组织预处理液中20 min，吸干周围水分，滴加试剂盒内终止反应缓冲液终止反应；滴加过氧化物酶标记的抗体，孵育，显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。计算海马细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）=凋亡细胞数/总细胞数。

1.2.5 免疫组织化学染色检测Bcl-2、caspase-3表达 海马组织石蜡切片进行常规脱蜡、水化，微波炉抗原修复、30 ml/L去离子双氧水、血清封闭；加入兔抗caspase-3抗体，孵育过夜，洗涤，加入抗兔IgG孵育30 min；显色后，蒸馏水冲洗，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。显微镜400倍下拍照，选择阳性细胞表达明显区域的5个相邻视野区，分别计算各视野区域的阳性细胞数及总细胞数，以阳性细胞百分率（阳性细胞百分率=阳性细胞数/总细胞数×100%）平均值作为Bcl-2表达；AniRes2005软件分析caspase-3蛋白条带光密度，caspase-3光密度与面积比值作为海马组织神经细胞caspase-3蛋白表达。胞百分率（阳性细胞百分率=阳性细胞数/总细胞数×100%）平均值作为Bcl-2表达；AniRes2005软件分析caspase-3蛋白条带光密度，caspase-3光密度与面积比值作为海马组织神经细胞caspase-3蛋白表达。

1.2.6 Western blot 取出备用海马组织并匀浆，提取蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳，常规转膜、封闭；分别加入兔抗c-Jun抗体（1∶1 000）、兔抗JNK抗体（1∶1 000）、兔抗P-JNK抗体（1∶1 000）等，孵育过夜，洗涤，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗IgG孵育1 h，显色，图像分析并测定蛋白条带光密度值，分别计算P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun值。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行统计学分析，数据符合正态分布，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析检验，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ig干预后大鼠海马神经元细胞凋亡情况 如图1所示，空白对照组大鼠海马神经元凋亡细胞数较少，模型组大鼠神经元凋亡细胞数较空白对照组显著增多，经干预后大鼠海马神经元凋亡细胞数较模型组减少，Ig高剂量组下降最为显著。

图1 各组大鼠海马神经元细胞凋亡情况（×400）Fig.1 Apoptosis of rats hippocampal neurons in each group（×400）

2.2 大鼠海马细胞AI、Bcl-2表达 与空白对照组相比，其余4组大鼠海马细胞AI明显升高，Bcl-2表达明显下降（P＜0.05），Ig高剂量组AI升高、Bcl-2下降最为显著（P＜0.05），Ig低剂量组与Ig中剂量组大鼠海马细胞AI、Bcl-2表达差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 各组大鼠海马细胞AI、Bcl-2表达比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of AI and Bcl-2 expression of hippocampus cellsin each groups（±s，n=10）

表1 各组大鼠海马细胞AI、Bcl-2表达比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of AI and Bcl-2 expression of hippocampus cellsin each groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with Ig low-dose，3）P＜0.05；compared with Ig middle-dose group，4）P＜0.05.

Groups Blank control Model Iglow-dose Igmiddle-dose Ig high-dose F P AI 5.12±1.33 42.36±8.581）22.63±4.361）2）20.54±4.021）2）12.03±2.361）2）3）4）85.453 P＜0.001 Bcl-2 1.02±0.08 0.33±0.041）2）0.52±0.051）2）0.53±0.081）2）0.90±0.041）2）3）4）211.027 P＜0.001

2.3 大鼠神经元损伤指标（P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3）表达比较 与空白对照组相比，其余4组大鼠P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表达明显升高（P＜0.05）；Ig高剂量组指标升高情况明显缓解（P＜0.05），Ig低剂量组与Ig中剂量组大鼠神经元损伤指标差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 各组大鼠P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表达比较（xˉ±s，n=10）Tab.2 Comparison of P-JNK/JNK，p-c-Jun/c-Jun，and caspase-3 test results of rats of each group（±s，n=10）

表2 各组大鼠P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表达比较（xˉ±s，n=10）Tab.2 Comparison of P-JNK/JNK，p-c-Jun/c-Jun，and caspase-3 test results of rats of each group（±s，n=10）

Note：Compared with blank control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with Ig low-dose，3）P＜0.05；compared with Ig middle-dose group，4）P＜0.05.

Groups Blank control Model Ig low-dose Ig middle-dose Ighigh-dose F P P-JNK/JNK 0.36±0.09 1.38±0.141）1.03±0.121）2）1.02±0.101）2）0.60±0.041）2）3）4）153.623 P＜0.001 p-c-Jun/c-Jun 0.21±0.05 2.15±0.191）2.03±0.111）2）2.01±0.131）2）0.85±0.071）2）3）4）367.448 P＜0.001 caspase-3 0.47±0.10 1.26±0.171）0.92±0.121）2）0.89±0.101）2）0.66±0.061）2）3）4）67.708 P＜0.001

3 讨论

SAH病因较为复杂，其中动脉瘤破裂是导致SAH发生的常见原因，约占85%，其他可能病因还有凝血功能障碍、非动脉瘤性出血、垂体卒中等［7］。研究显示，血管破裂后血管痉挛可能导致脑组织缺血缺氧，同时神经元、星形细胞等释放各种炎症因子及氧自由基，进一步加重脑组织损伤程度，进而导致海马神经元凋亡［8-9］。SAH主要治疗方式为以预防再出血、预防脑血管痉挛、脑积水、降低颅内压等为目标的常规药物治疗，但SAH后致残率及致死率仍较高，效果并不理想［10］。寻求治疗SAH的其他有效治疗方式具有重要意义。

Bcl-2是一种癌基因，具有显著抑制细胞凋亡作用，研究显示，Bcl-2过表达可减少氧自由基产生及脂质过氧化物形成［11］。Bcl-2可抑制钙离子跨膜流动，提示Bcl-2可通过调节胞内钙离子浓度调节细胞凋亡；此外，Bcl-2还可与Bcl-2家族外的蛋白磷酸酶Calcineurin、蛋白激酶Raf-1等结合，发挥抗凋亡作用［12-13］。本研究发现，SAH大鼠海马组织Bcl-2表达均较空白对照组明显降低，提示Bcl-2表达与SAH神经元损伤相关。

JNK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogenac tivatedproteinkinase，MAPK）家族成员，是含有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶，可将细胞外刺激信号传递至细胞核，进而引发细胞生物学反应的重要信号系统［14］。JNK作为MAPK信号通路的重要通路，参与多种细胞生长、增殖及凋亡等过程，同时参与细胞内外信号转导［15］。JNK可特异性抑制脑缺血导致的神经细胞凋亡，可阻断凋亡因子转入线粒体，通过激活下游底物将信号传至细胞凋亡因子，进而释放细胞色素C，导致细胞凋亡［16-17］。SAH早期脑损伤中，机体释放大量炎症因子，激活JNK，引发下游蛋白c-JNK磷酸化。p-c-Jun是一种活化状态，可在一定程度促进凋亡启动蛋白caspase-3表达及释放，进一步诱导细胞凋亡［18］。故推测JNK、c-Jun、caspase-3信号通路激活与细胞凋亡密切相关。本研究显示，SAH大鼠海马组织中神经元凋亡较为明显，海马细胞AI、P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表达较空白对照组明显升高，可见，JNK、c-Jun、caspase-3信号通路激活贯穿SAH后神经元损伤及凋亡进程，早期抑制该通路信号可能对减轻SAH后神经损伤具有一定作用。

Ig是与抗体分子相似的球蛋白，属于免疫活性分子，主要存在于血清中，具有特异性结合抗原功能。近年，静脉注射Ig已被广泛用于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病治疗，并取得较好疗效，在神经系统疾病中的应用不断增加［19］。2014年一项研究显示，Ig可通过抑制机体血浆及外周血单个核细胞产生IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子，进而减轻机体脑损伤及器官功能损伤［20］。但目前Ig治疗SAH的有效性及安全性相关机制的研究较少，为进一步观察Ig治疗SAH的效果，本研究成功构建SAH大鼠模型，并给予Ig治疗，结果显示，与模型组相比，经Ig治疗的大鼠海马细胞AI、P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表达降低，Bcl-2表达升高，且Ig高剂量组改善效果最为理想，而低剂量与中剂量组比较未见明显差异。提示Ig用于SAH治疗可通过调节Bcl-2表达及JNK、c-Jun、caspase-3信号通路，在一定程度修复大鼠海马神经元损伤。但相关研究较少，机制尚未明确，且无较多循证学依据作为理论支持，本研究结果的真实性、可靠性仍需前瞻性、大样本研究进一步验证。

综上所述，Ig可抑制SAH大鼠海马细胞凋亡、PJNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表达，提高Bcl-2表达，在一定程度上修复SAH大鼠海马神经元损伤。