基于免疫学机制探讨Twist2上调与牙周炎发生发展的关系①

牛 羚 陈 雷 孙 琳 刘欣蔚 刘立峰（北华大学附属医院，吉林132011）

牙周炎是一种常见可导致成人牙齿非正常脱落的重要疾病，是由革兰氏阴性厌氧杆菌感染导致的牙齿慢性骨吸收病变［1］。感染后细菌持续广泛地损伤牙周组织，随时间推移，各种慢性病症累积，出现牙龈出血、牙龈炎、牙槽骨吸收、牙齿松动甚至脱落等多种病症，严重影响牙齿健康和生活质量。目前，无论是药物还是手术治疗牙周炎多为对症治疗，无法实现牙周组织再生和修复。牙齿形成和维护是成骨与破骨的动态平衡过程，牙周炎中炎症环境抑制成骨细胞活动，导致牙槽骨骨代谢平衡失调。Twist2是一种对骨骼发生和发育起重要调节作用的基因，通过抑制成骨细胞生长使其停滞于前成骨细胞阶段，从而抑制骨形成［2-4］。Twist2表达于软骨发育早期的成软骨细胞和周围间质细胞细胞核中，发挥转录因子作用［4-5］。研究显示，Twist2对人牙周韧带间充质干细胞成骨分化具有调节作用，而Twist2与牙周炎发生发展是否相关尚未阐明，本研究通过模拟牙周炎炎症环境对牙周膜细胞中Twist2表达状况进行检测，初步探讨Twist2与牙周炎的关系，以期为牙周炎发生的免疫学机制和的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 牙周膜细胞及牙齿 牙周膜细胞均从门诊收集的健康牙齿上刮取，所有牙齿为因正畸需要而拔除的15～25岁青年的健康恒磨牙。

1.1.2 主要试剂与仪器 α-MEM培养基、0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、青霉素、链霉素、胎牛血（FBS）、Trizol试剂盒、qRT-PCR试剂盒（美国Invitrogen）；转录试剂盒（北京Transgen公司）；多聚甲醛（PFA）、细胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司）；磷酸酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、ECL显色试剂盒（美国Thermo Scientific公司）；PVDF膜（美国Milli Pore公司）；PCR检测试剂盒（TaKaRa公司）；电泳仪（爱宝来济南生物技术有限公司）；酶标仪（北京普朗新技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞获取与培养 将磨牙牙根面用含双抗的无菌PBS液反复冲洗，冠部采用75%酒精浸泡2 min，无菌条件下刮下牙根面1/3的牙周膜，无菌PBS液清洗，剪碎移至离心管，加入Ⅰ型胶原酶，37℃水浴消化20 min，终止消化后1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mlα-MEM培养液（含10%胎牛血清、100μg/ml抗坏血酸、2 mmol/L谷胺酰胺，0.5μg/ml青-链霉素），将细胞吹匀后接种至6孔板，37℃、5%CO2培养传代。

1.2.2 LPS模拟体外炎症环境 将传代后生长良好的牙周膜细胞以2×105个/ml接种至6孔板，加入α-MEM培养液，37℃、5%CO2培养至80%融合，去除原培养液，随机分为对照组和实验组，对照组加入α-MEM培养液，实验组加入含1μg/ml LPS的α-MEM培养液，继续培养24 h用于后续实验。

1.2.3 qRT-PCR检测Twist2表达 将培养24 h的2组细胞于无菌环境下去除培养基，加入Trizol试剂完全裂解，提取总RNA，Nano DropRND-1000检测RNA浓度和纯度。逆转录试剂盒逆转录为cDNA，按照400 ng反转10μl体系将总RNA进行反转录，按照反转录试剂盒说明书操作，采用qPCR试剂盒进行qRT-PCR检测，以U6为内参，引物由Invitrogen公司合成，序列如下：GAPDH F：5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3'（203 bp），R：5'-GATTTTGGAGGGATCTCGCT-3'；Twist2 F：5'-GCAAGAAGTCGAGCGAAGAT-3'（96 bp），R：5'-GCTCTGCAGCTCCTCGAA-3'。

1.2.4 Western blot检测Twist2蛋白表达 将牙周膜细胞裂解后离心收集上清，得到总蛋白，BCD法测定蛋白浓度。将样品蛋白移入预制的聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，电泳分离，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗4℃反应过夜，PBST洗膜5次，加入二抗（1∶1 500），常温摇床孵育1 h，PBST快速洗涤10 min，反复3次，暗室中红外线下发光液进行化学发光，曝光、显影、定影。扫描仪扫描胶片，目标条带灰度值分析，结果以目的蛋白条带光密度与内参蛋白条带光密度比值表示，实验重复3次。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析，加权处理后进行两组独立样本非参数秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测Twist2 mRNA表达 qRT-PCR结果显示，1μg/ml LPS刺激24 h后，与对照组相比，实验组Twist2 mRNA表达显著增加（P＜0.05），LPS处理后形成的炎症环境中Twist2 mRNA表达上调，炎症牙周膜细胞中Twist2 mRNA升高为正常牙周膜细胞的3倍（图1），说明Twist2 mRNA与牙周炎发生密切相关。

图1 2组细胞中Twist2 mRNA表达Fig.1 Expression of Twist2 mRNA in two groups of cells

2.2 Western blot检测Twist2蛋白表达 Western blot结果显示，1μg/ml LPS刺激24 h后，与对照组组比，实验组Twist2蛋白表达升高（P＜0.01），炎症环境中Twist2蛋白表达上调（P＜0.01，图2）。

图2 Western blot检测Twist2蛋白表达Fig.2 Western blot to detect expression of Twist2 protein

3 讨论

牙周炎是严重危害牙齿健康的慢性炎症性口腔疾病，是由牙周致病菌引起的炎症继发性骨吸收病变。牙周炎引起的各种牙齿损伤严重影响患者咀嚼进食，影响患者生活质量［6］。牙周炎现有治疗方法以抑制炎症为主，无法实现牙周骨组织修复再生，治疗结果不理想。牙周炎中炎症发展破坏成骨细胞和破骨细胞所维持的骨代谢的平衡，成骨细胞生长被各种炎症因子抑制，导致基质分泌矿化受阻。研究牙周炎牙槽骨吸收机制，寻找抑制骨吸收、促进骨形成的靶点对于防治牙周炎牙槽骨吸收具有重要意义。

Twist2是位于人2q37.3染色体、与真皮发育相关的细胞因子［7-8］。Twist2对骨骼发育、真皮发育、肿瘤生成及转移具有调节作用。，随人成骨细胞分化水平进展，Twist2 mRNA含量先增加后减少。研究显示，成骨细胞系MC3T3在分化过程中Twist2表达下调，提高Twist2表达，骨钙素（OC）和/或碱性磷酸酶（AP）含量下降，成骨细胞发育被抑制，停留于前成骨细胞阶段，骨形成被抑制［5］。采用Jagged-1处理牙周韧带间充质干细胞（HPDLs）分化后，Twist2 mRNA表达下调，而Notch通路靶基因hes-1、hey-1表达上升，HPDLs成骨增多，说明Twist2参与HPDLs分化调节过程［9］。本研究采用qRT-PCR和Western blot对正常牙周细胞和模拟炎症环境中的牙周细胞中的Twist2 mRNA及蛋白表达进行检测发现，炎症环境中Twist2 mRNA和蛋白表达均上调，说明Twist2与牙周炎发生发展相关，其作用机制可能为由于炎症及免疫细胞及因子刺激促进Twist2表达，导致牙周组织中成骨细胞分化受抑制，成骨被抑制，破骨相对增加，二者平衡被打破，牙槽骨被吸收却无法进行成骨补充，导致牙根部破坏，甚至牙齿损毁脱失。本研究显示，Twist2上调可能是牙周炎发生发展的相关因素，但未对其作用通路及机制进行深入研究，其与牙周炎发生发展如何作用及作用靶点有待进一步研究。

综上所述，炎症环境中Twist2表达上调，提示其与牙周炎发生发展中的骨吸收相关，可能成为抑制牙齿骨吸收或修复牙再生的靶点，为临床防治牙齿脱落提供新思路。